• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1988007892A1
    申请号:PCT/JP1988/000359
    申请日:1988-04-08
    公开日:1988-10-20
    发明作者:Yoshifumi Yura；Yuichi Yamamoto；Tadashi Samejima；Toshihiro Akaike
    申请人:Terumo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 糸田 »
    [0002] B リンパ球分離材および体液浄化材 [技術分野]
    [0003] 本発明は Bリンパ球分離材および体液浄化材に関するも のである。
    [0004] 本発明はさらに、 Bリンパ球分離材、 分離方法および分 離器に関するものである。 詳しく述べると、 本発明は、 末 梢血あるいは生体組織から得られるリンパ球分画を浮遊さ せた細胞懸濁液あるいは白血球分画などの Bリンパ球含有 液から Bリンパ球を処理液中の細胞成分の機能的損傷を最 小限にとどめ、 簡便かつ安価に高収率、'高純度で分離する Bリンパ球分離材、 分離方法および分離器を示すものであ る。 .
    [0005] 本発明はさらに体液浄化材、 体液净化装置および自己血 漿浄化法に関するものである。 詳しく述べると本発明は血 液等の体液中力 ら病因物蜇を高い選択性をもって吸着分離 する体液浄化材ぉよび体液浄化装置ならびにこれらを用い た自己血漿浄化法に関するものである。
    [0006] [背景技術〕 - リンパ球は、 血球系の幹細胞から分化した免疫機能を担 う細胞であり、 機能あるいは細胞膜形質等の点からいくつ かの亜群に分けられる。 それらは、 抗体を産生し体液性免 疫を担う Bリンパ球、 免疫調節性リンホ力ィンゃ炎症性リ ンホカイン等を産生し細胞性免疫を担う Tリンパ球、 およ びヌル細胞等のリンパ球サブクラスであり、 さらに、 T , Bリンパ球には、 機能的に異なるサブセッ 卜が存在する。 近年、 このような免疫学的特性の異なる Τ , Bリンパ球等 のサブクラスを、 機能的損傷を最小限にとどめ純粋に分離. 精製、 濃縮する技術が、 広範囲にわたる社会的分野で強く 望まれている。 例えば細胞学、 免疫学などの基礎研究にお いては生体内免疫系の生体外 U n v i t ro ) での解析におい て、 少なく とも T， Βリンパ球群までの分離が必要であり 臨床医学における診断、 治療等では、 機能低下あるいは昂 進した特定分画の移入あるいは除去が必要であり、 またリ ンパ系の生理活性物質の取得においては、 産生細胞分画の 分離、 濃縮が重要である。
    [0007] Τリンパ球と Βリンパ球の分離方法としては、 まずソデ ィゥムメ 卜リゾエイ 卜フィコール混液などの高密度等張液 を用いた比重遠心法により末稍血あるいは生体組織等から リンパ球分画を得、 続いてこれを分離処理して Τリンパ球 と Βリンパ球に分離するのが従来一般的である。 この後続 する分離処理方法と しては、 大きく （ 1 ) 細胞膜表面の特 異抗原、 レセプター、 免疫グロブリンを指標とするもの、 ( 2 ) 物理的細胞分離および （ 3 》 吸着クロマトグラフィ —の 3つに分けられる。 （ 1 ) の方法と しては、 ロゼッ ト 形成法、 （抗体や免疫複合体を結合させた） ァフ ィ二ティ 一クロマトグラフィ一、 抗体、 補体による細胞融解法、 マ ィ 卜ジェン活性化リンパ球の除去、 フルォレセイ ンァクチ べィテッ ドセルソ一ター （ F . A . C . S . ) などが知ら れているが、 これらの方法では、 生物学的に特異性の高い 強固な結合や刺激を受けるため、 インタク 卜な状態で Tリ ンパ球もしくは Bリンパ球を回収するのが難しく、 かつ大 量処理に向かない手法も多い。 また、 （ 2 〉 の方法と して は、 密度勾配遠心法、 細胞電気泳動法などが知られている が、 Tリンパ球と Bリンパ球との間に比重、 密度等の物理 的諸物性に際だった差がないため、 分離回収された細胞の 収率あるいは純度に高い精度が要求できない。 さらに （ 3 ) の方法と し は、 ナイロン、 テトロン、 綿繊維等の異物に 対する Tリンパ球と Bリンパ球の非特異的接着能力の差を 利用するものが知られているが、.高精度に分離細胞を得る ためには、 吸着担体の牛胎児血清 （ F C S〉 等による処理 が必要であることや流速などの実施条件の設定が難 ヽ マクロファージ等の不純物の混入も多い。 加えて、 これら の従来の方法は、 全般に、 繁雑な操作、 あるいは準備がと もない、 分離操作を行う場合の経験的技術的習熟力必須で あるという大きな課題も存在しているものであった。
    [0008] 一方、 近年、 体液中の特定成分が重篤の症状を惹起する 疾患の治療法と して血漿交換療法が行なわれている。 この 療法は病因物質の透析が困難な場合に特に効果的で、 重症 筋無力症、 関節リウマチ、 紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患、 糸球体腎炎、 気管支喘息、 多発性神経炎等の免疫関連疾患、 臓器移植に伴なう拒絶反応、 肝不全， 高血圧、 癌疾患など において適応されている。 このうち自己免疫疾患とは、 自 己の細胞や組織の持つ抗原に対して体液性あるいは細胞性 の免疫応答が起こり、 これによつて形成された自己に対す る抗体が原因となって発症する疾患をいう。
    [0009] しかしながら、 血漿交換療法は血漿成分の全てを無差別 に除去するため、 病因物質となる免疫グロブリン、 フイブ リノ一ゲン、 免疫複合体等を除去するのみならずアルブミ ンその他の有用な血漿成分をも喪失してしまう問題がある 加えて補充液と しての血漿や血漿製剤の不足、 血清肝炎、 A I D S . アレルギー症の併発、 副作用などといった多く の問題が指摘されている。
    [0010] このため病因物質となる免疫グロプリン、 フイブリノー ゲン、 免疫複合体等の大分子量'のタンパク質を選択的に除 去し、 アルブミンその他の有用な血漿成分を含む自己浄化 血漿を再び患者に返還する自己血漿浄化方法が研究されま た実施されるようになってきている。
    [0011] このような自己血漿浄化方法において用いられる吸着材 としては、 従来、 多孔性樹脂 （例えば、 スチレンジビニル ベンゼン共重合体であるアンバーライ 卜 X A D— 4 [ Aijibe r I i t e XAD - 4] , ローム アンド ハース社製等） 、 イオン 交換体 （例えば。カルボキシメチルセルロース、 ジェチルァ ミノェチルァガロース等） 、 無機多孔体 （例えば多孔質ガ ラス、 セラミ ックス等〉 ならびにァフ ィニティ一吸着材な どが知られている。 しかしながら従来知られる多孔性樹脂 ゃィオン交換体は吸着能が小さいのみならず吸着特異性が 低いため体液中のアルブミン等の有用成分をも吸着してし まう。 この結果、 これらを吸着材と して前記療法に適用す ると治療効果が不十分なだけでなく、 低蛋白血症に特有の 浸透圧異常を来たして浮腫を生じるなど安全性に問題があ る。 また無機多孔体は吸着能および吸着特性については比 較的良好ではあるものの未だ実用的には不十分である。
    [0012] これに対し、 ァフィ二ティー吸着材は優れた吸着能およ び吸着特性を有し体液浄化用吸着材と して有望視されてい る。 このタイプの吸着材はその吸着作用の相違から、 生物 学的ァフィ二ティ一吸着材と物理化学的ァフィニティー吸 着材とに分類される。 生物学的ァフィ二ティー吸着材は抗 原抗体結合、 補体結合、 F cフラグメント結合等の生物学 的相互作用で体液中の病因物質と結合し、 これを吸着する もので、 吸着特異性は極めて優れている。 しかしながら、 その多くは D N A、 抗 L D L抗体、 プロテイン A等の生理 活性高分子をリガンド （ 目的とする病因物質と親和性をも つ物質〉 と して用いるため、 原料が高価でかつ入手が困難 である問題がある。 またリガンドの安定性が乏しいため、 吸着材ゃこれを充填したカラムの製造、 滅菌、 貯蔵、 運搬、 保管に際して活性を保持するのが難しい。 加えて、 リガン ドが本来的に生理活性物質であるから、 これが血液と接触 した場合に所望の親和力を発揮するに止まらず、 本来の生 堙作用が発現して副作用を生じること も考慮しなければな らない。 しかも、 リガンドは異種タンパクであるため、 こ れが吸着材から遊離して溶出した場合には、 その抗原性に よる副作用が発生することとなる。 一方、 物理化学的ァフ ィニティー吸着材は静電結合や疎水結合などの物理的また は化学的相互作用で体液中の病因物質と結合し、 これを吸 着分離して除去するものである。'この場合のリガンドとし ては、 例えば、 ポリリジン、 メチル化アルブミン、 トリプ 卜ファン、 フヱニルァラニン等の合成物を用いることがで きる。 このため大量製造が可能で偭格も比較的安価であり、 话性が安定である等の利点を有している。 また血液と接触 した場合の安全性についても一般に優れたものが^いため、 前記療法において用いられる吸着材と して最も期待がもた れている。 さらに、 その作用および価格面からして、 上記 療法のための吸着材としてのみならず、 免疫グロプリン、 免疫複合休および免疫鬨連可溶性因子等の休液特定成分の 分離精製またはこれら成分の検査にも用途が期侍される。 このような物理化学的ァフィニティ一吸着材と して従来知 られているものと しては、 カルボキシル基またはスルホン 酸基を表面に有する多孔体 （特開昭 58— 1 4 7 7 1 Ό号、 同 57— 5 6 0 3 8号、 同 5 7— 7 5 14 】 号、 同 5 7— 1 70 26 3号、 同 5 7— 1 9 7 2 94号〉 、 疎水性ァミ ノ酸が結合されている親水性担体 （特開昭 5 7 - 1 22 S 7 5号、 同 58— 1 5 9 24号、 同 58— 1 6 585 9号、 同 58—】 6 586 1号） 、 変性免疫グロブリン （ 1 g G〉 が結合されている親水性担体 （特開昭 57— 77624号 同 57— 77625号、 同 57— 1 56035号） 、 メチ ル化アルブミンが結合されている多孔体 （特開昭 55一 1 20875号、 同 55— 1 25872号） 、 糖が結合され ている親水性担体 （特開昭 57— 1 34 1 64号、 同 58 一 1 33257号〉 、 プリン塩基またはピリ ミジン塩基あ るいは糖リン酸が結合されている多孔休 （特開昭 57一 1 92560号、 同 58— 6 1 752号、 同 58— 98 14 2号〉 、 糖鎖と親和性を有するペプチドが結合されている 不溶性担体 （特開昭 60— 1 63667号） などがある。
    [0013] しかしながら、 これら従来の物理化学的ァフィニティー 吸着材も上記のごとき自己血漿浄化療法による自己免疫疾 患等の治療における適用には未だ充分な性能を有するもの とはいえず、 さらに高い吸着効率および吸着特異性で病因 物質を除去することができ、 また体液に対する悪影響のよ り少ない浄化材および浄化装置ならびにこれらを用いた自 己血漿淨化法の開発が望まれていた。
    [0014] 従って、 本発明は、 新規な Bリンパ球分離材、 分離方法、 および分離器を提供することを目的とする。 本発明は-また、 細胞の諸活性に影響を与えることなく 、 簡便かつ安価に高 収率、 高純度で分離する Bリンパ球分離材、 分離方法およ び分離器を示すものである。 本発明はさらに、 大量処理に 適した Bリンパ球分離材、 分離方法および分離器を提供す ることを目的とする， また本発明は、 新規な体液浄化材、 体液浄化装置および 自己血漿浄化法を提供することを目的とする。 本発明はま た、 血液等の体液中から、 病因物質を高い吸着能および吸 着特異性をもって吸着除去し得る安全性の高い休液浄化材 および体液浄化装置ならびにこれらを用いた自己血漿浄化 法を提供することを目的とする。 本発明はさらに、 性能が 安定しており滅菌操作や貯蔵、 運搬、 保管が容易な体液浄 化材ぉよび体液浄化装置ならびにこれらを用いた自己血漿 浄化法を提供することを目的とする。 本発明はまた、 価格 的にも安価で大量製造が可能な体液浄化材、 体液浄化装置 ならびにこれらを用いた自己血漿浄化法を提供することを 目的とする。
    [0015] [発明の開示]
    [0016] 上記諸目的は、 水不溶性固休物質表面に、 免疫グロプリ ンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化 したことを特徴とする Bリンパ球分離材によって達成され る。 '
    [0017] 本発明はまた、 有機合成されたリガンドが、 複素環式化 合物類、 ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選ば れたものである Bリンパ球分離材を示すものである。 本発 明はさらに、 複素環式化合物類が、 化学療法剤およびその 誘導体、 ピリ ミジン関連化合物、 ピリジン関連化合物なら びにピラジン関連化合物からなる群から選ばれたものであ る Bリンパ球分離材を示すものである。 本発明はさらに複 素環式化合物類が、 サルフ ァ剤、 サルファ剤と P K 4 . 0 〜9 . ◦の色素との化合物、 2 - チォゥラシル、 イ ソニコ チン酸ヒ ドラジドおよびルミノールからなる群から選ばれ たものである Βリンパ球分離材を示すものである。 本発明 はまた、 ぺプチド類が、 アミノ酸数 2〜 1 0程度のオリゴ ぺプチドである Βリンパ球分離材を示すものである。 本発 明はさらに、 オリゴペプチドが、 リジン、 チロシンによる オリゴぺプチドあるいはァスパルチルフヱ二ルァラニンァ ルキルエステルである Βリンパ球分離材を示すものである , 本発明はまた、 アミノ酸類が、 ノ リ ン、 ロイシン、 チロシ ン、 フエ二ルァラニン、 イ ソロイ シン、 ト リプト ファン、 リジン、 アルギニン、 プロリンおよびァスパラギン酸ない しその誘導体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独ある いは複数組合せたものである Βリンパ球分離材を示すもの である。 本発明はさらにまた、 有機合成されたリガンドが- アルギニン'、 ァスパラギン酸、 フエ二ルァラニン、 プロ リ ンとスルファチアゾ一ルを組合せてなるものである Βリン パ球分離材を示すものである。 本発明はまた、 水不溶性固 体物質が、 合成有機高分子、 天然有機高分子または無機/物 からなる粒子体である Βリンパ球分離材を示すものである 本発明はまた、 水不溶性固体物質が、 平均粒径◦ . 0 5〜 5 翻の粒子体である Βリンパ球分離材を示すものである。 本発明はまた、 有機合成されたリガンドが、 水不溶性固体 表面に共有結合によ り固定化されているものである Βリン パ球分雛材を示すものである。
    [0018] 上記諸目的はまた、 水不溶性固体物質表面に免疫グロブ リンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定 化してなる分離材に、 Bリンパ球含有液を接触させ、 膜表 面に免疫グロプリン分子 （ S— I g〉 を有する Bリンパ球 を選択的に捕捉せしめることを特徴とする Bリンパ球の分 離方法により達成される。
    [0019] 本発明はまた、 分離材に固定化されたリガンドが、 複素 環式化合物類、 ペプチド類およびアミノ酸類からなる群か ら選ばれたものである Bリンパ球の分離方法を示すもので ある。 本発明はさらに、 複素環式化合物類が、 化学療法剤 およびその誘導体、 ピリ ミジン関連化合物、 ピリジン閧連 化合物ならびにピ'ラジン関連化合物からなる群から選ばれ たものである Bリンパ球の分離方法を示す のである。 本 発明はさらに複素環式化合物類が、 サルファ剤、 サルファ 剤と P K 4 . 0〜9 . 0の色素との化合物、 2 -チォゥラ シル、 イ ソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミノ一ルからな る群から選ばれたものである Βリンパ球の分離方法を示す / ものである。 本発明はまたペプチド類が、 アミノ酸数 2〜 ; 1 ◦程度のオリゴぺプチドである Βリンパ球の分離方法を 示すものである。 本発明はさらに、 オリゴペプチドが、 リ ジン、 チロシンによるオリゴぺプチドあるいはァスバルチ ルフエ二ルァラニンアルキルエステルである Β リ ンパ球の 分離方法を示すものである。 本発明はまた、 アミノ酸類が ノ リン、 ロイ シン、 チロシン、 フエ二ルァラニン、 イ ソ口 イ シン、 卜 リプトフアン'、 リジン、 アルギニン、 プロリン およびァスパラギン酸ないしその誘導休からなる群から選 ばれたアミノ酸を単独あるいは複数組合せたものである B リンパ球の分離方法を示すものである。 本発明はさらに、 分離材に固定されたされたリガンドが、 アルギニン、 ァス パラギン酸、 フヱニルァラニン、 プロリンとスルファチア ゾールを組合せてなるものである Bリンパ球の分離方法を 示すものである。 本発明はさらに、 水不溶性固体物質が、 合成有機高分子、 天然有機高分子または無機物からなるも のである Bリンパ球の分離方法を示すものである。 本発明 はまた洗浄液と して等張緩衝液を用いるものである B リン パ球の分離方法を示すものである。 本発明はさらに分離材 をゥシ血清アルブミンで処理した後、 リンパ球懸濁液と接 触させるものである Bリンパ球の分離方法を示すものであ る。
    [0020] 上記諸目的はさらに、 粒子状の水不溶性固体物質表面に 免疫グロプリンと高い親和性を有する有機合成されたリガ ンドを固定化してなる分離材を充填したカラムを有するこ とを特徴とする Bリンパ球の分離器によ り達成される。 本発明はまたカラムがボリプ口ピレンまたはポリカーボ ネートからなるものである B リンパ球の分離器を示すもの である。 本発明はさらにカラムの出入口と分離材層との閬 には、 Bリンパ球含有液中の細胞成分は通過するが分離材 は通過できない網目を有するフィルターを備えてなるもの である Bリンパ球の分離器を示すものである。 本発明はさ らにフィルターがポリエステルまたはポリアミ ドからなる ものである Bリンパ球の分離器を示すものである。
    [0021] 上記諸目的はさらに、 水不溶性固休物質表面にスぺーサ 一を介して、 免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合 成されたリガンドが固定化されていることを特徴とする B リンパ球分離材によって達成される。
    [0022] 本発明はまた、 スぺーサ一が少なくとも 2個以上の炭素 原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を含む炭化水素鎖 を骨格とするものである Bリンパ球分離材を示すものであ る。 本発明はさらに、 スぺーサ一のメチレンの繰返しが 4 個以上の直鎖アルキルを骨格とするものである Bリンパ球 分離材を示すものである。 本発明は¾た、 スぺーサ一が重 合度 1〜5 ◦のエチレンオキサイ ド骨格を有するものであ る Bリンパ球分離材を示すものである。 本発明はまた、 有 機合成されたリガンドが、 複素環式化合物類、 ペプチド類 およびアミノ酸類からなる群から選ばれたものである； Bリ ンパ球分離材を示すものである。 本発明はさらに、 複'素環 式化合物類が、 化学療法剤およびその誘導体、 ピリ ミジン 関連化合物、 ピリジン関連化合物ならびにピラジン関連化 合物からなる群から選ばれたものである Bリンパ球分離材 を示すものである。 本発明はさらに複素環式化合物類が、 サルファ剤、 サルファ剤と P K 4 · 0〜9 . 0の色素との 化合物、 2 - チォゥラシル、 イ ソニコチン酸ヒ ドラジドぉ よびルミノールからなる群から選ばれたものである Bリン パ球分離材を示すものである。 本発明はまた、 ペプチド類 、 アミノ酸数 2 〜 1 0程度のオリゴべプチドである Bリ ンパ球分離材を示すものである。 本発明はさらに、 オリゴ ペプチドが、 リジン、 チロシンによるオリゴペプチドある いはァスパルチルフヱ二ルァラニンアルキルエステルであ る Bリンパ球分離材を示すものである。 本発明はまた、 ァ ミノ酸類が、 ノ リン、 ロイ シン、 チロシン、 フヱニルァラ ニン、 イ ソロイ シン、 トリフ。トフアン、 リジン、 アルギニ ン、 プロリンおよびァスパラギン酸ないしその誘導体から なる群から選ばれたアミノ酸を単独あるいは複数組合せた ものである Bリンパ球分離材を示すものである。 本発明は さらにまた、 有機合成されたリガンドが、 アルギニン、 ァ スパラギン酸、 フヱニルァラニン、 プロリンとスルファチ ァゾールを組合せてなるものである Bリンパ球分離材を示 すものである。 本発明はまた、 水不溶性固体物質が、 合成 有機高分子、 天然有機高分子または無機物からなる粒子体 である Bリンパ球分離材を示すものである。 本発明はまた、 水不溶性固体物質が、 平均粒径 0 . 0 5 〜 5 羅の粒子体で ある Bリンパ球分離材を示すものである。
    [0023] 上記諸目的はまた、 水不溶性固体物質表面にスぺーサー を介して免疫グロプリンと高い親和性を有する有機合成さ れたリガンドを固定化してなる分離材に、 B リンパ球含有 液を接触させ、 膜表面に免疫グロプリン分子 （ S — I g〉 を有する Bリンパ球を選択的に捕捉せしめることを特徴と する Bリンパ球の分離方法により達成される。
    [0024] 本発明はまた分離材におけるスぺ一サ一が少なくとも 2 個以上の炭素原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を含 む炭化水素鎖を骨格とするものである Bリンパ球の分離方 法を示すものである。 本発明はさらに分離材におけるスぺ ーサ一のメチレンの繰返しが 4個以上の直鎮アルキルを骨 格とするものである Bリンパ球の分離方法を示すものであ る。 本発明はまた、 分離材におけるスベーサ一が重合度 1 〜 5◦のエチレンォキサイ ド'骨格を有するものである Bリ ンパ球の分離方.法を示すものである。 本発明はまた、 分離 材に固定化されたリガンドが、 複素環式化合物類、 ぺプチ ド類およびアミノ酸類からなる群から選ばれたものである Bリンパ球の分離方法を示すものである。 本発明はさらに 複素環式化合物類が、 化学療法剤およびその誘導体、 ピリ ミジン関連化合物、 ピリジン関連化合物ならびにビラジン 関連化合物からなる群から選ばれたものである Bリンパ球 の分離方法を示すものである。 本発明はさらに複素環式化 合物類が、 サルファ剤、 サルファ剤と P K 4 , 0〜9 . 0 の色素との化合物、 2 -チォゥラシル、 イ ソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミノールからなる群から選ばれたもので ある Bリンパ球の分離方法を示すものである。 本発明はま たペアチド類が、 アミノ酸数 2〜 1 0程度のオリゴぺプチ ドであるリンパ球の分離方法を示すものである。 本発明は さらに、 オリゴペプチドが、 リジン、 チロシンによるオリ ゴぺプチドあるいはァスパルチルフェ二ルァラニンアルキ ルエステルである Bリンパ球の分離方法を示すものである 本発明はまた、 アミノ酸類が、 ノ リ ン、 ロイシン、 チロシ ン、 フエ二ルァラニン、 イ ソロイ シン、 ト リプ卜ファン、 リジン、 アルギニン、 プロリンおよびァスパラギン酸ない しその誘導体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独ある いは複数組合せたものである Bリンパ球の分離方法を示す ものである。 本発明はさらに、 分離材に固定化されたリガ ンドが、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 フエ二ルァラニン プロリンとスルファチアゾールを組合せてなるものである Bリンパ球の分離方法を示すものである。 本発明はさら.に 水不溶性固体物質が、 合成有機高分子、 天然有機高分子ま たは無機物からなるものである Bリンパ球の分離方法を示 すものである。 本発明はまた洗浄液と して等張緩衝液を用 いるものである Bリンパ球の分離方法を示すものである。
    [0025] 上記諸目的はさらに、 粒子状の水不溶性固体物質表面に スぺーサーを介して免疫グロブリンと高い親和性を有する 有機合成されたリガンドを固定化してなる分離材を充填し たカラムを有することを Bリンパ球の分離器により達成さ れる。
    [0026] 本発明はまたカラムがボリプロピレンまたはボリ力一ボ ネートからなるものである B リンパ球の分離-器を示すもの である。 本発明はさらにカラムの出入口と分離材層との間 には、 Bリンパ球含有液中の細胞成分は通過するが分離材 は通過できない網目を有するフィルターを備えてなるもの である Bリンパ球の分離器を示すものである。 本発明はさ らにフィルターがポリエステルまたはポリアミ ドからなる ものである Bリンパ球の分離器を示すものである。
    [0027] さらにまた上記諸目的は、 水不溶性担休表面にジぺプチ ドあるいはその誘導休を固定化したことを特徴とする体液 浄化材により達成される。
    [0028] 本発明はまた、 ジべプチドあるいはその誘導体が酸性ァ ミノ酸と芳香環アミノ酸または複素環アミノ酸とのジぺプ チドあるいはその誘導体である体液浄化材を示すものであ る。 本発明はさらに、 ジペプチドあるいはその誘導体がァ スパラギン酸もしくはグルタミン酸とフヱニルァラニン、 チロシン、 トリプトファン、 プロリンもしくはヒ ドロキシ フ。口リンとのジペプチドあるいはその誘導体である休液浄 化材を示すものである。 本発明はさらに、 ジペプチドある いはその誘導休がァスパルチルフエ二ルァラニンあるいは その誘導体である体液浄化材を示すものである。 本発明は さらにまた、 ジぺプチドあるいはその誘導体がァスバルチ ルフヱ二ルァラニンメチルエス干ルである体液浄化材を示 すものである。 本発明はまた、 水不溶性担体が粒子状担体 である体液浄化材を示すものである。 本発明はさらに、 粒 子状担体が平均粒径 0 . 0 5〜 5關のものである体液浄化 材を示すものである。 本発明はまた、 水不溶性担体が多孔 性のものである体液浄化材を示すものである。 本発明はま た、 水不溶性担体が合成有機高分子、 天然有機高分子また は無機物からなるものである体液浄化材を示すものである 本発明はさらに、 水不溶性担休が多孔性ァクリル酸エステ ル系粒子または多孔性キトサン粒子であ'る体液浄化材を示 すものである。 さらに本発明は、 ジペプチドあるいはその 誘導体が水不溶性担体表面に共有結合により固定化されて いるものである体液浄化材を示すものである。 本発明はま た、 ジぺプチドあるいはその誘導休がスベーサ一を介して 水不溶性担体表面に共有結合により固定化されているもの. である体液浄化材を示すものである。 - 上記諸目的はまた、 水不溶性担体表面にジぺプチドある いはその誘導体を固定化してなる浄化材を充填したカラム を有することを特徴とする体液浄化装置により達成される < 本発明はまた、 湿熟滅菌処理されたものである体液浄化 装置を示すものである。 本発明はまた、 浄化材が粒子状の 水不溶性担体表面にジぺプチドあるいはその誘導体を固定 化してなるものである体液浄化装置を示すものである-。 本 発明はまた、 カラムがポリプロピレンまた'はポリカ一ボネ ―トからなるものである体液浄化装置を示すものである。 本発明はさらに、 カラムの出入口と浄化材層との間には、 体液成分は通過するが浄化材は通過できない網目を有する フ ィルタ一を備えてなるものである休液浄化装置を示すも のである。 本発明はまた、 ジペプチドあるいはその誘導体 が酸性アミノ酸と芳香環アミノ酸または複素環アミノ酸と のジべプチドあるいはその誘導体である体液浄化装置を示 すものである。 本発明はさらに、 ジペプチドあるいはその 誘導休がァスパラギン酸もしくはグルタミン酸とフ'ェニル ァラニン、 チロシン、 トリプトファン、 ァロリンもしくは ヒ ドロキシプロリンとのジぺプチドあるいはその誘導体で ある体液浄化装置を示すものである。 本発明はさらに、 ジ ぺプチドあるいはその誘導体がァスパルチルフエ二ルァラ ニンあるいはその誘導体である免疫吸着装置を示すもので ' - ある。 本発明はさらにまた、 ジペプチドあるいはその誘導 体がァスパルチルフェニルァラニンメチルエステルである 体液浄化装置を示すものである。 本発明はまた、 粒子状の 水不溶性担体が平均粒径 0 . ◦ 5〜5 のものである体液 浄化装置を示すものである。 本発明はさらに、 水不溶性担 体が多孔性のものである体液浄化装置を示すものである。 本発明はまた、 水不溶性担体が合成有機高分子、 天然有機 高分子または無機物からなるものである体液浄化装置を示 すものであ-る。 本発明はさらに、 水不溶性担体が多孔-性ァ クリル酸エステル系粒子または多孔性キトサン粒子である 体液浄化装置を示すものである。 本発明はまた、 ジべプチ ドあるいはその誘導体が水不溶性担休表面に共有結合によ り固定化されているものである体液浄化装置を示すもので ある。 本発明はまた、 ジペプチドあるいはその誘導体がス ぺーサ一を介して水不溶性担体表面に共有結合によ り固定 化されているものである休液浄化装置を示すものである。
    [0029] 上記諸目的はまた、 患者から導出された血液を、 血球成 分と血槳成分とに分離し、 得られた血漿成分を水不溶性担 体表面にジぺプチドあるいはその誘導体を固定化したこと を特徴とする体液浄化材と接触させ、 このようにして体液 浄化材で処理した血漿成分を再び血球成分と混合して患者 に返還する自已血漿浄化法によって達成される。
    [0030] 本発明はまた、 ジぺプチドあるいはその誘導体が酸性ァ ミノ酸と芳香環アミノ酸または複素環アミノ酸とのジぺプ チドあるいはその誘導体である自己血漿浄化法を示すもの である。 本発明はさらに、 ジペプチドあるいはその誘導体 がァスパラギン酸もしくはグルタミン酸とフエ二ルァラ二 ン、 チロシン、 ト リプトファン、 プロリ ンもしくはヒ ドロ キシプロリンとのジべプチドあるいはその誘導体である自 己血漿浄化法を示すものである。 本発明はさらに、 ジぺプ チドあるいはその誘導体がァスパルチルフエ二ルァラニン あるいはその誘導体である自己血漿浄化法を示すものであ る。 本発明はさらにまた、 ジペプチドあるいはその誘導体 がァスパルチルフヱ二ルァラニンメチルエステルである自 己血漿浄化法を示すものである。 本発明はまた、 水不溶性 担体が粒子状担体である自己血槳浄化法を示すものである。 本発明はさらに、 粒子状担体が平均粒径 0 . 0 5〜 5 Mの ものである自己血漿浄化法を示すものである。 本発明はま 2 〇
    [0031] た、 水不溶性担体が多孔性のものである自己血漿浄化法を 示すものである。 本発明はまた、 水不溶性担体が合成有機 高分子、 天然有機高分子または無機物からなるものである 自己血漿浄化法を示すものである。 本発明はさらに、 水不 溶性担体が多孔性アクリル酸エステル系粒子または多孔性 キトサン粒子である自己血漿浄化法を示すものである。 さ らに本発明は、 ジペプチドあるいはその誘導体が水不溶性 担体表面に共有結合により固定化されているものである自 己血漿浄化法を示すものである。 本発明はまた、 ジぺプチ ドあるいはその誘導体がスベーサーを介して水不溶性担体 表面に共有結合により固定化されているものである自己血 漿浄化法を示すものである。 .
    [0032] なお、 本明細書において 「リガンド j とはタンパク質に 特異的に結合する物質をいう。
    [0033] また、 本発明の体液浄化材ぉよび体液浄化装置が対象と する被吸着物質である病因物質 は、 体液中に含まれる有 害なタンパク質であるが、 より詳しく述べると、 通常の免 疫グロブリン （ I g A， I g D , I g E； I g G , I g M： 、 リウマチ因子、 あるいは抗梭钪体、 抗 D N A抗体、 抗リ ンパ球抗体、 抗赤血球抗体、 抗血小板抗体、 抗ァセチルコ リ ンレセプター抗体、 抗大腸抗体、 抗腎糸球体 · 肺基底膜 抗体、 抗表皮棘細胞間デスモゾーム抗体、 抗インスリンレ セプタ一抗体、 抗ミエリン抗体、 抗血友病第 VI因子抗体な どの自己抗体、 免疫グロブリンの還元生成物、 免疫グロブ リン間または免疫グロプリンと他の物質 （特に抗原および 抗原様物質） との複合物、 リンフォカイ ン、 補体、 フイブ リノーゲン等が含まれるものである。
    [0034] [図面の簡単な説明]
    [0035] 第 1図は本発明の Bリンパ球分離器の一実施例の使用態 様を示す模式図、 第 2図は本発明の体液浄化装置の一実施 例を模式的に示す断面図であり、 また第 3図は本発明の体 液浄化装置を組入れた体外循環療法回路図である。
    [0036] [発明を実施するための最良の形態]
    [0037] 公知のごと く Bリンパ球の細胞膜表面には、 その分化の 度合などにより、 I g G、 I g M、 I g Aなどそのクラス は異なるが、 いずれも免疫グロブリンが存在しており、 一 方 Tリンパ球の細胞膜表面には、 実質的にこのような免疫 グロプリンが存在しないことが知られている。
    [0038] しかして、 本発明に係る B リンパ球分離材は、 水不溶性 固体物質表面に、 免疫グロプリンと高い親和性を有する有 機合成されたリガンドを固定化したことを特徴とするもの であるので、 該 Bリンパ球分離材を例えばリンパ球懸濁液 等の Bリンパ球含有液と接触させた際、 細胞膜表面に免疫 グロプリンを有する Bリンパ球と極めて高い親和力を示し、 Bリンパ球は Bリンパ球分離材に極めて高い確率で捕捉さ れる。 一方、 細胞膜表面に免疫グロブリンを有しない Tリ ンパ球に対しては、 親和力を示さず、 Tリンパ球は B リン パ球分離材に捕捉されない。 従って、 分離材吸着分画と分 離材非吸着分画とを分離することによって Bリンパ球と T リンパ球を高純度、 高収率で得ることができるものである さらに、 本発明に係る別の B リ ンパ球分離材は、 水不溶 性固体物質表面にスぺ一サーを介して、 免疫グロブリンと 高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化した- ことを特徴とするものであるので、 該 B リ ンパ球分離材を 例えばリンバ球懸濁液と接触させた際、 Bリンパ球分離材 は細胞膜表面に免疫グロブリンを有する Bリンパ球に対し て極めて高い親和力を示し、 Bリンパ球は Bリンパ球分離 材に極めて高い確率で捕捉される。 一方、 細胞膜表面に免 疫グロプリンを有しない Tリンパ球に対しては、 Bリンパ 球分離材は親和力を示さず、 さらに水不溶性固体物質表面 と免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成されたリ ガンドとの間に介在するスぺーサ一が、 その流動性や排除 体積効果によって細胞が分離材表面に接近して相互作用す ることを妨げるために、 上記のように B リ ンパ球分離材と の枏互作用力の弱い Tリンパ球の非特異的接着を抑制する ために、 Tリンパ球は Bリンパ球分離材に実質的に捕捉さ れない。 従って、 分離材吸着分画と分籬材非吸着分画とを 分離することによって Bリンパ球と Tリンパ球をより高純 度、 高収率で得ることができるものである。
    [0039] このため、 例えば該 Bリンパ球分離材を充填した液の出 入口を有する力ラムにリンパ球戀溻液を一定速度で注入し 直ちに等張緩衝液などの洗浄液によってカラム内の非吸着 分画を洗い流すことで丁リンパ球が簡便、 迅速かつ大量に 高純度、 高収率で得ることができる。 このように本発明は 一種の吸着クロマトグラフィ一的手法を適用するものであ るが、 本発明の Bリンパ球分離材の場合、 従来のァフィ二 ティークロマトグラフィーのごとく 、 担体に抗体や免疫複 合体を固定化した場合とは異なり、 Bリンパ球に対しては 明確な親和性を有するが、 生物学的に特異性の高い刺激等 はいつさい与えないという特性を有するため、 分離された 丁リンパ球および Bリンパ球はィンタク トな状態を保持し ているものである。 さらに、 本発明の B リンパ球分離村の この様な親和性は、 動物種の由来に影響しないことも確め られ、 分離操作も数分で完了し、 また、 リンパ球懸濁液の 組成も単純等張塩溶液でよくゥシ胎児血清等の異種動物由 来の濃厚血清も必要がないというように、 応用上における 利点を数多く有するものである。
    [0040] また上記のごとき Bリンパ球分離材において用いられる 免疫グロプリンと高い親和性を有する有機合成されたリガ ンドは、 体液中の前記のごとき病因物質 （免疫グロプリン を含む〉 に対しても高い親和性を有することが推測される が、 Bリンパ球分離材のリガンドと して好適な化合物のひ とつと して今回見出されたペプチド類のうち、 ジペプチド あるいはその誘導体が病因物質の選択的吸着にも極めて有 用なものであることがまた明らかなものとなり、 さらに別 の発明に達したものである。 すなわち、 本発明に係わる体液浄化材は、 水不溶性担休 表面にジぺプチドあるいはその誘導体を固定化したことを 特徴とする一種の物理化学的ァフィ二ティー吸着材であつ て、 後述する実施例において示されるように病因物質に対 して極めて高い吸着効率および吸着特異性を示すものであ る。
    [0041] 一般に、 疎水性化合物だけで構成された浄化材、 即ち疎 水結合性の強い浄化材には病因物質のみならず体液中のァ ルブミン分画などの有用なタンパク質も多く付着するため 病因物質の選択的除去には適さない。 逆に水素結合性の強 い親水性化合物、 あるいは静電結合性の強い荷電基を多く 有する化合物で構成された浄化材では、 タンパク質の付着 量が著しく低いため病因物質を充分 ;に吸着できない。 これ らの点から考えると、 体液中の病因物質のみを高い吸着効 率および吸着特異性をもって分離除去するためには、 種々 の相互作用が適度に組合さった浄化材が好適なものである といえる。
    [0042] 本発明の体液浄化材は、 上記のごとき病因物質、 特に、 免 ¾グロブリンないし免疫グロブリン関連化合物 （以下、 免疫グロプリン系化合物と称する。 Λの吸着において、 該 浄化材の有する疎水性および静電特性が被吸着化合物 （免 疫グロブリン系化合物） の吸着部分のアミノ酸残基とそれ ぞれ相互作用力を発镩し、 また該浄化材表面の立体構造が 被吸着化合物 （免疫グロブリン系化合物） の分子内ポケ 卜に適度に当てはまつたために好ましい結果が得られたも のと解釈できる。
    [0043] 加えて、 本発明の体液浄化材においてリガンドと して用 いられる化合物はジぺプチドであり、 従来生物学的ァフィ 二ティ一吸着材において用いられている生理活性高分子な どとは異なり、 比較的安価で容易に合成あるいは入手でき るものでありかつ安定性にも優れるものである。 このため 本発明に係わる体液浄化材および体液浄化装置の製造、 滅 菌、 貯蔵、 運搬、 保管などはいずれも極めて容易でかっこ れらの状態における浄化材の话性の低減ないしは喪失もな い。 さらに体液と接触した場合の安全性についても、 仮に リガンドであるジぺプチドが浄化材ょり遊離したと しても ジぺプチドは体液中において生理作用を発現すること もな くまた容易に分解きれアミノ酸と して代謝されるものであ るために極めて良好なものである。
    [0044] 以下、 本発明を実施態様に基づきよ り詳細に説明するが、 本発明の理解を容易なものとするために、 「 Bリンパ球分 離材 1 」 、 「 Bリンパ球分離材 E 」 、 「 Bリンパ球分離方 法および分離器」 、 「体液浄化材」 、 '「体液浄化装置; ί 、 「自己血漿浄化法」 および f 実施例」 という文節を設ける。
    [0045] Bリンパ球分離材ェ
    [0046] 本発明の Bリ ンパ球分離材は、 水不溶性固体物質表面に、 免疫グロプリンと高い親和性を有する有機合成されたリガ ンドを固定化したことを特徴とするものである。 このよう に免疫グロブリンと高い親和性を有するリガンドとしては 複素環式化合物類、 ぺプチド類およびアミノ酸類などが挙 げられ、 これらはリガンドとして単独であるいは複数組合 せて用いられる。
    [0047] 本発明において甩ぃられる複素環式化合物類としては、 具体的には、 五員複素環式化合物ではフランとその誘導体 チォフェンとその誘導体およびジチオラン誘導体、 ァゾー ル類など、 また六員複素環式化合物ではピリジンおよび関 連化合物、 キノリンおよび関連化合物、 アタリジンおよび 関連化合物、 ピリ ミジンおよび関連化合物、 ピラン よび ピロンおよび関連化合物、 また縮合環系複素化合物では、 フエノキサジン、 フエノチアジン、 プテリンおよびァロキ サジン化合物など、 さらにボルフィ リン環系複素化合物で は、 プリン塩基、 核酸、 へミン、 クロロフ ィル、 ビタミン B 1 およびフタロシアニンなど、 その他アル力ロイ ドなど が挙げられる。 これらの複素環式化合物のうちでは、 化学 療法剤およびその誘導体、 ピリ ミジン関連化合物、 ピリジ ン関違化合物ならびにピラジン関連化合物などが特に好ま しい結果を与え、 さらにサルファ剤、 サルファ剤と p K 4 0〜9 . ◦の色素との化合物、 2 -チォゥラシル、 イソ二 コチン酸ヒ ドラジドおよびルミノールなどがより好ましい 結果を与える。 なお P K 4 . 0〜9 . 0の色素とは、 エイ チ. ジエイ . コ一ンズ ノくィォロジカ/レ スティ ンズ， ァ ール. ディ一 . リ トル， ザ ゥイ リアンス アンド ウイ ルキンス カンパ二一， バルチモア， 1977 [H.J. Conn's Biological Stains, . D. Little, The Wi I I ians S Wi I ki ns Company, Baltimore, 1977 ] に記載されている各種指示 薬、 組織化学用色素の内で P K値が 4 . 0〜9 . ◦のもの をいう。 色素は P K値が免疫グロプリン Gの等電点にほぼ 等しいものが好ましく、 P K値 4 . 0〜9 . ◦の範囲がこ れにあたる。 さらにサルファ剤またはサルファ剤と Ρ Κ 4 0〜9 . ◦の色素との化合物の中では、 サルファ剤がスル ファチアゾール、 スルファメチゾ一ル、 スルフ イ ソメゾ一 ルであり、 Ρ Κ 4 · 0〜9 . ◦の色素がラクモイ ド、 プリ リアントイエロ一、 あるいはフ： rノールレツ ドである場合 が特に好ましい結果を与える。 これらのサルファ剤は、 N 1 -異項環系化合物であり、 複素環がァゾール類に属し、 それぞれチアゾール、 2 - メチルチアゾ一ル、 2 - メチル ィ ソ才キサゾールである。
    [0048] 本発明の Bリンパ球分離材において、 免疫グロプリンと 高い親和性を有するリガンドと して好適に用いられる複素 環式化合物のピリジン、 ピリ ミジン、 ァゾール類のへテロ 原子は孤立電子対を有し、 プロ トンァクセプターと して働 く また解離基の少ない複素環は疎水性を示す。 さらにサ ルファ剤のスルフォンアミ ド部分、 2 - チォゥラシルのチ オール基あるいは水酸基、 ィ ソニコチン酸ヒ ドラジドの酸 アミ ド部分、 ルミノールのカルボ二/レ基とィ ミノ基は水素 結合性を有している。 この様に、 B リンパ球細胞膜表面の 免疫グロブリンと該化合物との相互作用において、 該化合 物の主要部分の疎水性、 ヘテロ原子による静電特性、 主要 部分付近の水素結合性が、 免疫グロプリン分子鎖中の吸着 サイ トのアミノ酸残基とそれぞれ相互作用力を発揮し、 加 えて、 該化合物の立体構造が細胞膜表面の免疫グロプリン 分子内ポケッ トに適度に当てはまったために、 非抗原 Z抗 体系の高い親和性が得られたものと考えられる。
    [0049] また、 本発明において用いられるペプチド類は、 少なく とも 2個以上のアミノ酸がペプチド結合を介して得られる 合成化合物であり、 アミノ酸数 2〜 1 0程度のオリゴぺプ チドが好ましい結果を与える。 さら'にこれらのオリゴぺプ チドの中でも、 免疫グロプリン分子と特異的な結合性を有 するプロティン A等の公知の天然物質のァフィニテイーサ ィ トを模倣したものが好ましく、 特にリジン、 チロシンに よるオリゴぺプチド、 あるいはァスパルチルフエ二ルァラ ニンメチルエステルなどのァスパルチルフェ二ルァラニン アルキルエステル等の化合物が極めて良好な結果を与える これらのペアチド類に関しても、 免疫ク"ロブリン分子鎖 中の特定な疎水性サイ 卜や荷電サイ 卜との相互作用によつ て非抗原 Z抗体系の高い親和性が得られたものと考えられ る。
    [0050] また本発明において用いられるアミノ酸類は、 単種のァ ミノ酸、 あるいは 2種以上のアミノ酸を同時に用いたもの であり、 疏水性のパリ ン、 ロイ シン-、 チロシン、 フエニル ァラニン 、 イソロイシン、 トリプトファンや、 塩基性のリ ジン、 アルギニン、 あるいは酸性のプロリンおよびァスパ ラギン酸およびその誘導体を単独あるいは複数組合せて用 いたものが特に良好な結果を与える。 なおこれらの物質の D , L体の如何は問われない。 ' これらのアミノ酸類に関しても、 先に述べたペプチド類 と同時に、 免疫グロブリン分子鎖中の特定な疎水性サイ ト や荷電サイ 卜との相互作用によって、 免疫グロブリンを有 する Bリンパ球と非抗原 Z抗体系の高い親和性が得られた ものと考えられる。
    [0051] さらに、 以上述べたような有機合成されたリガンドは、 単独で用いても Bリンパ球に対する親和性を十分に発揮で きるが、 特に、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 フエニルァ ラニン、 プロリン等のアミノ酸と複素環式化合物であるス ルファチアゾ一ルを同時にリガンドと して用いた場合には. 極めて良好な結果が得られる。 また、 上記に列記したこの ようなリガンドは、 ヒ ト、 ゥシ、 ラッ ト由来の免疫グロブ リンに対して高い親和性を持つことから、 対象とする細胞 の動物種の如何を問わないものである可能性が高いものと なる。
    [0052] 本発明の B リンパ球分離材において、 このような有機合 成されたリガンドを固定化させる担体と しての水不溶性固 体物質と しては、 ァガロース系、 デキス トラン系、 セル口 —ス系、 ボリアク リル'アミ ド系、 ボリ ビニルアルコール系， ポリビニルピ口リ ドン系、 ポリアタリロニトリル系、 スチ レン - ジビニルベンゼン共重舍体、 ポリスチレン系、 ァク リル酸エステル系、 メタクリル酸エステル系、 ポリエチレ ン系、 ポリプロピレン系、 ポリ 4 - フッ化工チレン系、 ェ チレン -酢酸ビニル共重合体系、 ポリアミ ド系、 ポリ力一 ボネ一卜系、 ポリフッ化ビニリデン系、 ポリビニルホルマ ール系、 ポリアリレート系、 ポリエ一テルスルフォン系な どの有機高分子、 ガラス系、 アルミナ系、 チタン系、 活性 炭系、 セラミックス系などの無機物などが挙げられるが、 特に細胞接着性の高すぎないもの、 すなわち、 細胞 -担体 間の相互作用が比較的穏やかなものが好まれ、 特に好まし くはアクリル酸エステル系などが用いられる。 また、 生体 由来の天然有機高分子であるコラーゲン、 キトサン等も用 いられ得る。 このような水不溶性固休物質の形態としては 特に限定されず、 平板上のものも用いることができるが、 好ましくは、 粒子状、 特に平均粒径が◦ . 0 5 〜 5 誦の粒 子状のものが望ましい。 なお平均粒径は J I S - Z - 8 8 0 1に規定されるフルイを用いて分級 た後、 各級の上限 粒径と下限粒径の中間値を各級の粒径と し、 その重量平均 と して算出したものである。 さらに粒子形状は細胞に物理 的な損傷を与えにくいことや均一な粒子を得やすい等の点 から球形のものが好ましい。
    [0053] 本発明の Bリンパ球分離材において、 上記のごとき水不 溶性固体物質表面に有機合成されたリガンドを固定化する 方法と しては、 共有結合、 イオン結合、 物理的吸着、 包理 あるいは担体表面への沈澱不溶化などあらゆる公知の方法 を用いることができるが、 固定化されたリガンドの溶出性 からみて、 共有結合により固定、 不溶化して用いるのが好 ましい。 そのため一般に、 固定化酵素、 ァフィ二ティーク 口マトグラフィ一の分野で用いられる公知の不溶性担体の 活性化法およびリガンドの固定化方法が、 好ましく用いら れ得る。
    [0054] Bリンパ球分離材！！
    [0055] ' 本発明の別の Bリンパ球分離材は、 水不溶性固休物質表 面にスぺ一サ一を介して、 免疫グロプリンと高い親和性を 有する有機合成されたリガンドが固定化されていることを 特徴とするものである。 この Bリンパ球において用いられ る免疫グロプリンと高い親和性を有するリガンドと しては 上記に挙げたものと同様なものが用いられ、 その作用も同 様であり、 またこのような有機合成されたリガンドを固定 化させる担体と しての水不溶性固体物質と しても、 上記に 挙げたものと同様なものが用いられる。
    [0056] 本発明のこの別の Bリンパ球分離材において.用いられる スぺーサ一とは、 分子状をなし、 水不溶性固体物質表面と リガンドとの間に介在して任意の長さを設けることができ るものであればよく 、 水不溶性固体物質表面と リガンドと の結合を立体的に阻害しない限り、 どのような骨格構造を όつものでもよい。 水不溶性固体物質表面と リガンドとの 間にこのようなスベーサ一が介在していると、 スぺ一サー の流動性や排除体積効果によって、 細胞が分離材表面に接 近して相互作用することが妨げられ、 この結果、 分離材と の相互作用力の弱い Tリンパ球の接着が優先的に抑制され るものと考えられ、 Tリンパ球の非特異的接着を抑制する 効果が生まれる。
    [0057] このようなスぺ一サ一は、 少なく とも 2個以上の炭素原 子を有する、 疎水性の炭化水素鎖ないしは分子鎖に水酸基. カルボキシル基等ゃェ一テル酸素などの特性基を含む親水 性の炭化水素鎖を骨格とするものであり、 またその分子鎖 の両端に有していたエポキシ基ゃィソチオシァネート基等 の公知の反応性官能基を、 水不溶性物質表面およびリガン ドのアミノ基ゃカルボキシル基にそれぞれ反応させて分子 鎖の一端において水不溶性物質表面に、 他端においてリガ ンドに共有結合しているものである。
    [0058] スぺ一サ一骨格としての疎水性の炭化水素鎖としては、 単純なメチレンの籙返しからなるアルキル鎖、 このアルキ ル鎖中に一部炭素二重結合やベンゼン環等の種々の環式置 換基が含まれるもの、 さらにはこのよ な分子鎖に分岐が ある のなどがあるが、 好ましくはメチレンの籙返しが 4 個以上、 より好ましくはメチレンの繰返しが 4〜 1 ◦個の 直鎖アルキル鎖が特に Tリンパ球の非特異的接着を抑制す るスぺーサ一と しての効果の高いものである。 またスぺ一 サ一骨格と しての特性基を含む親水性の炭化水素鎖と して は、 上記のアルキル鎖中に水酸基、 カルボキジレ基、 ある いはアミノ基等の解離性の官能基を有するものや、 エーテ ル酸素を有するものなどがあり、 同様に炭素二重結合や環 式置換基あるいは分子鎖の分岐があっても構わないが、 好 ましくは重合度 1〜 5 0、 より好ましくは。重合度 4〜3 0 のエチレンォキサイ ド骨格が、 特に Tリンパ球の非特異的 接着を抑制するスぺーサーと しての効果の高いものである。
    [0059] なお水不溶性固体物質表面およびリガンドに共有結合し て本発明の Bリンパ球分離材におけるスぺーサ一となり得 る化合物の好ましい例と しては、 次に示すような構造を有 ' するものがあるが、 もちろんこれらに限定されるものでは ない。
    [0060] C H2 - C H C H 2 〇 R， 〇 C H2 C H - C H 2
    [0061] 〇 〇
    [0062] [式中 R 1 は炭素数 2〜 2 0個、 好ま しくはメチレンの綠 返しが 4〜 1 0個の直鎖アルキルある。 ]
    [0063] R 2 3
    [0064] II )
    [0065] CH2 - CHCH2 0 -f CH2 CHO +„ CH2 じ HOCト I 2 CH~CH2
    [0066] 、0,- 、0, .
    [0067] [式中、 R2 , R 3 はそれぞれ水素または炭素数 1 4個 のアルキル基であり、 また ηは 0 ノ
    [0068] 〜4 9 、 よ り好まレ 、は 3〜 2 9の数である ] 本発明のこの別の Bリンパ球分離材を得るには、 例えば、 固定化酵素、 ァフィ二ティークロマトグラフィーの分野で 用いられる公知の方法に基づき、 上記構造式 （ I ) または ( II ) で表わされるビスエポキシドのような両端に反応性 官能基を有し、 スベーサ一として適度な鎖長の分子骨格を 有する化合物の該反応性官能基を、 それぞれ水不溶性固体 物質表面およびリガンドのアミノ基ゃカルボキシル基に反 応させて共有結合させればよく、 免疫グロプリンに高い親 和性を有するリガンドはスペ^"サーを介して水不溶性固体 物質表面に共有結合により強固に結合されることとなる。
    [0069] Bリンパ球分離方法および分離器 本発明の Bリンパ球の分離方法は、 上記のごとき水不溶 性固体物質表面に免疫グ口ブリ.ン Gと高い親和性を有する 有機合成されたリガンドを固定化してなる分離材、 または 上記のごとき水不溶性固体物質表面にスぺーサーを介して 免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成させたリガ ンドを固定してなる分離材に、 Bリンパ球含有液を接触さ せ、 膜表面に免疫グロプリン分子 （ S— I g〉 を有する B リンパ球を選択的に捕捉せしめること ίこより、 Βリンパ球 を効率よく分離するものである。
    [0070] 本発明の Βリンパ球の分離方法において処理対象として 用いられる Βリンパ球含有液と しては、 全血、 全血を遠心 処理する等により得られた白血球分画、 およびリンパ球懸 濁液などが含まれる。 リンパ球懸濁液は、 末梢血あるいは 組織液などのリンパ球を含む細胞浮遊液から、 應漿分離器 あるいは遠心分離装置等を用いてリンパ球分画を他の血球 成分から精製し、 このリンパ球分画を適当な溶液中に浮遊 させることにより調製される。 リンパ球分画を浮遊させる 溶液は、 単純な等張塩溶液であっても、 また自己血清等を 含むものであっても構わない。
    [0071] 本発明の Bリンパ球の分離方法によると、 血液中から B リンパ球を簡便かつ迅速に高収率で分離除去することが可 能であり、 しかも分離工程における血液成分の機能的損傷 も少ないことから、 免疫機能に関係した疾患の診断、 治療 ゃリンパ球由来の生理活性物質を得るための基礎技術に応 用できるものである。 例えば治療を目的と した場合、 伴性 リンパ球増殖症候群などの原発性免疫不全症候群、 あるい は P r e B細胞性リンパ性白血病、 B細胞性悪牲リンパ性 白血病、 B細胞性慢性リンパ性白血病、 瀘胞性リンパ腫、 B u r k ϊ t t リンパ腫、 マクログロブリン血症、 鎖病、 ミエローマ、 ァ鎖病、 α鎖病などのリンパ系腫瘍等の B細 胞が異常増殖する疾患において、 異常増殖した Β細胞を有 効に除去することができれば、 リンパ球サブクラス、 サブ ボピユレーシヨ ンの比率が変化し、 異常増殖、 分化異常を 仰制するための Τ細胞 （増殖仰制はサプレッサ一 Τ細胞、 分化促進はヘルパー Τ細胞） からのシグナルが有効に働き 出し 、 症状は改善すると考えられるためである。
    [0072] 本発明の Βリンパ球の分離方法において、 リンパ球懸濁 液等の Bリンパ球含有液との Bリンパ球分離材との接触は、 平板状の Bリンパ球分離材に Bリンパ球含有液を接触させ て行なうことも可能であるが、 水不溶性固体物質表面上の 有機合成されたリガンドの絶対量や十分な細胞吸着スぺ一 スを獲得するという点から、 粒子状の Bリンパ球分離材を 充填してなるカラムを有する Bリンパ球分離器を用い、 こ れに Bリンパ球含有液を通液することにより好適に行なわ れる。
    [0073] この粒子状の Bリンパ球分離材を充填してなるカラムを 有する Bリンパ球分離器において、 カラム容器を構成する 材質としては、 ボリプロピレン、 ボリカーボネート、 ポリ スチレン、 ポリメチルメタクリレート等の合成樹脂、 ガラ スおよびステンレス等の金属などが使用でき,るが、 オート ' クレーブ滅菌が可能で取り扱いやすいポリプロピレンやポ リ力一ボネ一ト等が特に好ましい。 またこの Bリンパ球分- 離器のカラムの出入口と Bリンパ球分離材を充填した分離 材層との間には、 Bリンパ球含有液中の細胞成分は通過す るが分離材は通過できない網目を有するフィルターを備え ていることが好ましく、 このフィルターを構成する材質と しては、 生理学的に不活性で強度の高いものであればよい が、 特にポリエステル、 ボリアミ ドであることが好まれる < 第 1図は、 本発明に係る Bリンパ球分離器の一実施例の 使用態様を示す模式図である。 第 1図に示すように Bリン " パ球含有液と してのリンパ球を浮遊させたリンパ球懸濁液 1は Bリンパ球分離器の導入口 9から、 Bリンパ球分離材 5を充填されたカラム 6内にポンプ 2によって注入される なお Bリンパ球分離材 5は、 フ ィルター 4 a， 4 bによ り カラム 6内に保持されている。 リンパ球戀溻液 1 を注入後 洗浄液 8をポンプ 3でカラムら内に注入し、 カラム内に残 留している非捕捉細胞をリンスし、 導出口 1 0よ り流出し てくる処理液 7を回収する。 この処理液 7は、 分離材非吸 着分画であり、 高純度、 高収率で Tリンパ球を含むもので ある。
    [0074] Bリンパ球分離材 5に捕捉された細胞 （ Bリンパ球〉 を 溶離することなく、 捕捉されなかった細胞 （ Tリンパ球〉 を洗い落とすために用いられる洗浄液 8と しては、 等張緩 衝液、 細胞培養液等が用 られ、 好ましくは 2偭カチオン フリーの等張緩衝液、 特に好ましくはハンクス緩衝液 （ Ha nk' s balanced salt solution ： HBSS)などが用いられる。 またリンパ球懸濁液 1の通液方法は、 必要に応じて連続あ るいは非連続にしてもよく 、 さらには一定時間のィンキュ ベ一ションを加えても構わない。
    [0075] さらに Bリンパ球分離材 5に捕捉された細胞を回収する 場合には、 洗浄液 8によ り非捕捉細胞を洗浄除去した後、 Bリンパ球分離材 5に捕捉された細胞と Bリンパ.球分離 ¾ 5表面のリガン"ドとの結合力を適当な手段で弱めてやれば よく 、 例えば、 アミノ酸、 糖類あるいはアルブミンを含む 等張緩衝液等を溶離剤と して用い、 さらにカラム 6に物理 的振勤を与えるなどして溶離剤を流し捕捉細胞 溶離回収 すればよい。
    [0076] また、 本発明の B リ ンパ球の分離方法において、 B リ ン パ球分離材に対する Tリンパ球の非特異的付着性を低下さ せ、 収率を向上させるために、 公知のごとく、 分離材にゥ シ血清アルブミン等により処理を行なった後、 Bリンパ球 分離操作を行なうことも可能である。
    [0077] 体液浄化材
    [0078] 本発明の体液浄化材は、 水不溶性担体表面にジぺプチド あるいはその誘導体を固定化したことを特徴とするもので
    [0079] — ある。
    [0080] 本発明の体液浄化材においてリガンドとして用いられる ジぺァチドあるいはその誘導体とは、 同種あるいは異種の 2個のァミノ酸が互いに一方の力ルボキシル基と他方のァ ミノ基との間で脱水して酸アミ ド結合すなわちペプチド結 合することによって形成された化合物あるいはその誘導体 である。 このようなジペプチドあるいはその誘導体として 好ましくはァスパラギン酸、 グルタミン酸、 ァスパラギン グルタミンなどのような酸性アミノ酸と、 フエ二ルァラ二 ン、 チロシン、 ジョードチロシン、 スリナミンなどの芳香 環アミノ酸またはトリプトファン、 プロリ ン、 ヒ ドロキシ プロリン'、 ヒスチジンなどのような複素環アミノ酸とのジ ペプチドあるいはその誘導体であり 、 特に好ましくはァス パラギン酸もしくはグルタミン酸とフヱ二ルァラニン、 チ 口シン、 ト リプトファン、 プロリンも しくはヒ ドロキシプ ロリンとのジペプチドあるいはその誘導体である。 これら のうちより望ましいジぺプチドあるいはその誘導体と して はァスパラギン酸とフエ二ルァラニンとのジぺプチドであ るァスパルチルフヱ二ルァラニンおよびその誘導体が挙げ られ、 特にァスパルチルフエ二ルァラニンメチルエステル が好適なものである。
    [0081] このようなジぺプチドは病因物質、 特に免疫グロプリン 系化合物との相互作用において、 該化合物の主要部分の疎 水性、 ヘテロ原子による静電特性が、 病因物質の分子鎖中 の吸着サイ トのアミノ酸残基とそれぞれ相互作用力を発揮 し、 加えて該化合物の立体構造が病因物質.の分子内ボケッ 卜に適度に当てはまったために、 非抗原/抗体系の高い親 和性が得られたものと考えられる。
    [0082] 本発明の体液浄化材において、 このような有機合成され たリガンドを固定化させる水不溶性担体と しては、 親水性 のものであっても疎水性のものであってもよく 、 例えば、 ァガロース系、 デキス トラン系、 セルロース系、 ボリァク リルアミ ド系、 ポリ ビニルアルコ一ル系、 ポリ ビニルピロ リ 卜'ン系、 ホ。リアク リロニト リル系、 スチレン - ジビニル ベンゼン共重合体、 ホ。リスチレン系、 ァク リル酸エステル 系、 メタク リル酸エステル系、 ボリエチレ ン系、 ポリプロ ピレン系 . ボリ 4 - フ ツ化工チレン系、 エチレン - 酢酸ビ ニル共重合体系、 ポリアミ ド系、 ボリ力一ボネー ト系、 ホ' リフッ化ビニリデン系、 ポリビニルホルマール系、 ポリア リレー卜系、 ポリエーテルスルフオン系などの有機高分子 ガラス系、 アルミナ系、 チタン系、 活性炭系、 セラミック ス系などの無機物や生体由来の天然有機高分子であるコラ 一ゲン、 キトサン等が用いられ得る。 また通常、 固定化酵 素、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一に用いられる公知 の担体は特別の限定なく用いることができる。 このような 水不溶性担体の形態としては、 特に限定されず、 例えば、 粒子状、 繊維状、 中空糸状、 膜状、 平板状など各種の形状 を用いることができるが、 血液、 血漿等の体液の通液性、
    [0083] 4- 浄化材調製時の取扱いの簡便性などの点から、 好ましく ί 粒子状、 特に平均粒径が◦ . ◦ 5 〜 5 腿の粒子状のものが 望ましい。 なお平均粒径は J I S— Z— 8 8 0 1に規定さ れるフルイを用いて分級した後、 各級の上限粒径と下限粒 径の中間値を各級の粒径と し、 その重量平均と して算出し たものである。 さらに粒子形状は細胞に物理的な損傷を与 えにくいことや均一な粒子を得やすい等の点から球形のも のが好ましい。 また水不溶性担体は、 その表面に上記のご ときジぺプチドあるいはその誘導体をより多量に保 する ことができ、 これによりさらに高い吸着効率を発 される ために、 好ましくは、 多孔性構造を有する のであること が望ましく、 さらに多孔体の有する細孔の平均孔径が 1 0 0 〜 5 0 0 0 A . 特に 2 0 ϋ 〜 3 0 ◦ 0 Αの範囲にあるも のが望まれる。 水不溶性担体が多孔性構造を有する場合に おいて、 細孔の平均孔径を 1 ◦ 0〜5 ◦ 0 0 Aとするの'は. 平均孔径が 1 0 0 Aよりも小さいと体液中の病因物質の細 孔内への浸透拡散が阻害され吸着される病因物質の量が少 なくなる恐れがあり、 一方、 平均孔径が 5 0 0 0 Aよ りも 大きいと多孔体の強度が低下しかつ表面積が減少するため に実用的でなくなるためである。 なお、 こごで言う平均孔 径とは、 多孔体に水銀を圧入して侵入した水銀量から細孔 の量を求め、 さらに圧入に要する圧力から孔径を求める水 銀圧入ボロシメーターによって測定された数値を指すもの である。
    [0084] このような点を考慮に入れて、 水不溶性担体と して特に 好ましいものと しては、 多孔性ァクリル酸エステル系粒子 および多孔性キトサン粒子を挙げることができる。
    [0085] 本発明の体液浄化材においてジぺプチドあるいはその誘 導体を水不溶性担体表面に固定化する方法としては、 共有 結合、 イオン結合、 物理的吸着、 包埋あるいは担体表面へ の沈澱不溶化などあらゆる公知の方法を用いることができ るが、 固定化されたリガンドの溶出性からみて、 共有結合 によ り固定、 不溶化して用いるのが好ましい。 そのため一 般に、 固定化酵素、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーの 分野で用いられる公知の不溶性担体の活性化法およびリガ ンドの固定化方法が好ましく用いられ得る。 またさらに、 必要に応じて水不溶性担体表面と リガンドであるジぺプチ ドあるいはその誘導体との間に任意の長さのスべ一サ一を 導入することも可能である。 この場合用いられるスべ一サ 一とは、 分子状をなし、 水不溶性担体表面とリガンドとの 間に介在して任意の長さを設けることができるものであれ ばよく、 水不溶性担体表面とリガンドとの結合を立体的に 阻害しない限り、 どのような骨格構造をもつものでもよい < 水不溶性担体表面とリガンドとの間にこのようなスぺーサ 一が介在していると、 スぺーサ一の流動性や排除体積効果 によって、 休液成分が浄化材表面に接近して相互作用する ことが妨げられ、 この結果、 浄化材との相互作用力の弱い アルブミン分画等の接着が優先的に抑制されるものと考え られ、 これら非病因物質の非特異的接着を抑制する効果が 生まれる。 なおこのように水不溶性担休表面とリガンドと の間にスぺーサ一を介在させる場合においてもその固定化 方法としては前記に述べたものと同様に公知のいずれの方 法によってもよいが、 好ましくは共有結合による固定化で ある。
    [0086] 体液浄化装置
    [0087] 本発明の体液浄化装置は、 上記のごと^き水不¾性担体、 好ましくは粒子状の水不溶性担体表面にジぺプチドあ ぃ はその誘導体を固定化してなる体液浄化材を充填したカラ ムを有するこどを特徴とするものである。
    [0088] この体液浄化材を充填してなるカラムを有する体液浄化 装置において、 カラム容器を構成する材質と しては、 ポリ プロピレン、 ポリ力一ボネー 卜、 ボリスチレン、 ホ。リメチ ルメタクリレー卜等の合成樹脂、 ガラスおよびステンレス 等の金属などが使用できるが、 ォ一卜クレープ滅菌が可能 で取り扱いやすいボリプロピレンゃポリカーボネー卜等が 特に好ましい。 またこの体液浄化装置のカラムの出入口と 体液浄化材を充填した体液浄化材層との間には、 体液成分 は通過するが浄化材は通過できない網目を有するフィルタ —を備えていることが好ましく、 このフ ィルターを構成す る材質と しては、 生理学的に不话性で強度の高いものであ ればよいが、 特にポリエステル、 ボリアミ ドであることが 好まれる。
    [0089] 第 2図は、 本発明に係る体液浄化装置の一実施例を模式 的に示す断面図である。 この実施例において体液浄化装置
    [0090] 1 1は、 流体導入口 1 2および流体導出口 1 3を備えてな るカラム容器 1 4に粒子状の体液挣化材 1 5が充填されて おり、 該浄化材 1 5は、 流体導入口 1 2および流体導出口
    [0091] 1 3の近傍に設けられたフィルター 6 a、 6 bによりカラ ム容器内に保持されている。
    [0092] この体液浄化装置 1 1を用いて血液の体外循環療法を行 なうには、 例えば第 3図に示すような回路に体液浄化装置 1 1 を組入れておこなう。 患者よ りの血液は、 血液導入口 1 7よ り回路内に導入されて血液ボンプ 1 8、 チャンバ一 1 9を通って一定流速にて血漿分離装置 2 0へ供耠され血 球成分と血漿成分とに分離される 血漿分離装置 2 0の血 漿導出口 2 1 よ り導出された血漿は血漿ボンプ 2 2 、 チヤ ンバー 2 3を通って体液浄化装置 1 1へ流体導入口 ]. 2よ り導入され、 カラム容器内 1 4に収容された体液浄化材 1 5で吸着処理された後、 流体導出口 1 3より導出される。 体液浄化装置 1 1で処理された血漿成分は、 混合チャンバ —2 4において、 血漿分離装置 2 0の血球導出口 2 5より 導出され血球成分と再び混合され、 恒温橹 2 6を通って血 液導出口 2 7より患者の体内にもどされる。
    [0093] なお、 本発明の体液浄化装置は、 使用前に精製水、 生理 食塩水等を装置内に充填し、 加熟することによって湿熟滅 菌処理を施される。
    [0094] 自己血漿浄化法
    [0095] 本発明の自己血槳浄化法は、 導出され、た血液を、'血球成 分と血漿成分とに分離し、 得られた血漿成分を上記のごと き水不溶性-担休表面にジベプチドあるいはその誘導体を固 定化してなる体液浄化材と接触させ、 このように体液浄化 材により処理した血槳成分を再び血球成分と混合して患者 に返還するものである。
    [0096] 前記したように水不溶性担体表面にジペプチドあるいは その誘導体を固定化してなる体液浄化材は、 体液中に含ま れる病因物質、 すなわち、 体液中に含まれる.有害なタンパ ク質である通常の免疫グロブリ ン （ I g A , I g D , I g E , I g G , I g M ) 、 リウマチ因子、 あ いは抗核抗体 抗 D N A抗体、 抗リンパ球抗体、 抗赤血球抗体、 抗血小板 抗体、 抗アセチルコ リ ンレセプダー抗体、 抗大腸抗体、 抗 腎糸球体 · 肺基底膜抗体、 抗表皮棘細胞間デスモゾーム抗 体、 抗イ ンスリンレセプター抗体、 抗ミエリ ン抗体、 抗血 友病第 VI因子抗体などの自己抗体、 免疫グロブリンの還元 生成物、 免疫グロプリン間または免疫グロプリンと他の物 質 （特に抗原および抗原様物質） との複合物、 リンフォカ ィン、 補体、 フィプリノーゲン等、 特に免疫グロプリン系 化合物を選択的に吸着でき、 一方、 アルブミンその他の有 用な血漿成分に対しては吸着性を示さない。 このためこの 体液浄化材を自己血漿浄化法に適用した場合、 低蛋白血症 'に特有の、浸透圧異常を来たして浮腫を生じるなどの副次的 作用の発生を見ることがなく 、 前記の病因物質によりもた らされる重症筋無力症、 関節リウマチ、 紅斑性狼瘡等の自 己免疫疾患、 糸球体腎炎、 気'管支喘息、 多発性神経炎等の. 免疫関連疾患、 臓器移植に伴なう拒絶反応、 肝不全， 高血 圧、 癌疾患などの疾患において、 極めて顕著な治療効果が 期待されること となる。
    [0097] 本発明の自己血漿浄化法は、 バッチ方式において行なう ことも可能であるが、 望ましくは前記体液浄化装置の項に おいて述べたように体外循環血液回路を組立てて連続的に 処理 'することが患者に対する負担の軽減の上から望まし ^。 実施例
    [0098] 以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 実施例 1
    [0099] 水不溶性固体物質 して、 ォキシラン基を有するァクリ ルビーズ （オイパ一ギッ ト C ( EC〉 ， レーム フアルマ [ Rohm P arma ] 社製] (平均粒径 0. 1 5薩 〉 を用い、 リガンドとして複素環式化合物のスルファチアゾ一ル （ S T ) を固定化した Bリンパ球選択捕捉型分離材を作成した。
    [0100] まず、 0. 2 Mの炭酸緩衝液 （ p H 1 0〉 とジメチルホ ルムアミ ドの混合液 （容量比 2 ： 3 ) 1◦ O ml中に、 濃度 〇 . Μとなるようにスルファチアゾールを溶解した。 該 溶液中にォキシラン - ァクリルビーズ （架橋性モノマーの 比率 3 0重量 を◦ . 1〜0. 2mg"Zinlの割合で投入し 脱気した。 これを 80 Cの水洛中で 3時間加温した後に、 ブラッ ドミキサー （萱垣医理科工業製， BM- 1 0 1 〉 を 使用して室温で一晩撹拌した。 次いで、 未反応のォキシラ ン基を除去するために I'M ( p H 8 ) のエタノールアミン- 溶液を添加し一晩撹拌した。 その後、 蒸留水、 塩化ナトリ ゥム 0. 5 Mを含有する 0. 〇 2 M ( p H4 ) の酢酸緩衝 液、 0. 2 M ( P H 1 0 ) の炭酸緩衝液、 で順次洗浄しス ルファチアゾール固定化ァクリルビ一ズ （ E C— S T〉 を 得た。
    [0101] このようにして得られた分離材を、 内径 3腿 、 外径 4mm のテフロンチュ一ブからなるカラムに充填し、 該チュ—ブ の両端にボリエステル製フィルター （ 1 5 0メ ッシュ〉 を 有する端子を接続し、 カラム内に吸着材を保持させた。 こ の吸着剤を充填したカラム内をハンクス緩衝液 （ H B S S ； P H 7. 2， C a2+, M g2Tフリー〉 で置換し、 続く T , Bリンパ球分離操作に供した。
    [0102] 一方リンパ球懸濁液は、 ウィスター系ラッ トの腸間膜リ ンパ節から単離されたリンパ球分画を、 H B S Sを用いて 80 0 X 1 04 細胞 Zmlに懸濁 · 希釈することによって調 製され、 このリンパ球懸濁液は氷冷下で保存され、 希釈後 ュ 時間以内に使用された。 ' 上記のごとき調製されたリンパ球懸濁液〗 mlをディスポ 一サブルシリンジとシリンジポンプ （ と もにテルモ株式会 社製） によって、 1〜3 mlZ分の流速で、 分離材を充填し た上記カラムに注入し、 直ちに H B B Sを用いて 2 mlZ分 の流速で同様にカラムに注入してカラム内を洗浄し、 分離 操作を完了した。 回収した処理液は自動血球計数装置 （ォ ルソ イ ンスツルメンッ [ORTHO INSTRUMENTS ] 社製， E L T - 8 ) を用いて細胞密度を計測され、 続いて処理液中 の Bリンパ球のみをラッ 卜 1 g Gに対する抗体を結合させ た F I TC (マイルズ [MILES ] 社製〉 を用いて蛍光染色 し、 蛍光顕微鏡によって処理液中の Bリンパ球をカウント し 、 処理液中の T， Bリ ンパ球比を算出した。 以上の操作 によって、 処理液中の Tリンパ球の収率 （ y ) と純度 （ p ) 、 および Bリンバ球に対する特異性を表す指標と して捕捉 性 （ S R〉 を得た。 結果を第 1表に示す。
    [0103] 実施例 2
    [0104] 水不溶性固体物質として、 ォキシラン基を有するァクリ ルビーズ （オイパ一ギッ ト C， レーム フアルマ社製] に スルファチアゾ一ルとアルギニン、 ァスパラギン酸、 フエ 二ルァラニン、 プロリンを 1 6 ： 1 : 1 : 1の割合で混合 した混合液を用いて、 実施例 1 と同様にして、 スルファチ ァゾール、 アルギニン、 ァスパラギン酸 フエ二ルァラ二 ン、 プロリン固定化ァクリルビーズ （ EC— ST A〉 を作 、成した。
    [0105] この E C— STAを用いて実施例 1 と同様にして Τ, B リンパ球分離操作を行なった。 収率 （ y〉 と純度 （ P 〉 、 および捕捉性 （ S R〉 に関して得られた結果を第 1表に示 す。
    [0106] 実施例 3
    [0107] 水不溶性固体物質と して架橋タイプのキトサンビーズ ( c itopearl ( C H ) , 富士紡績㈱製〉 （平均粒径 0. 2 5 を用いてスルファチアゾ一ルを固定化した Bリンパ 球選択捕捉型分離材を作成した。 ~ まず、 水酸化ナトリウムで P H 7. 0に調整した 5 W/V %グルタルアルデヒ ド （ GA ) 水溶液にキトサンビーズを 浸して脱気した後、 ブラッ ドミキサー （萱垣医理科工業製， BM- 1 0 1 ) を用いて室温で一晩撹拌した。 蒸溜水で洗 浄したこの反応物を、 ジメチルホルムアミ ドと 1 0 m M塩 す化- カルシウム溶液 （ P H 8 ) の混液 （容量比 2 ： 3 ) に溶 解させた 0. 1 Mスルファチアゾ一ル溶液に加えて脱気し、 ブラッ ドミキサーで一晩撹拌した後、 ジメチルホルムアミ ドおよび蒸溜水でキトサンビーズを洗浄した。 次に、 未反 応のアルデヒ ド基をプロッキングするために、 1 Mェタノ —ルアミン （ P H 8〉 溶液中で脱気した後、 ブラッ ドミキ サ一で一晩撹拌した。 これを再び蒸留水で洗浄し、 l '/v %の水素化ホウ素ナトリウムを含む 1 0 mM塩化カルシゥ ム溶液 （ P H 8 ) に加えて 4°Cで反応させ、 ダルタルアル デヒ ドのアルデヒ ド基とキ卜サンおよびスルファチアゾ一 ルのアミノ基との反応によって生じたァゾメチン基を還元 させて安定化した。 最後に蒸.留水、 0 . 5 M塩化ナトリウ ムを含有する 0. 0 2 M酢酸緩衝液 （ P H 4 ) 、 および 0. 2 M炭酸緩衝液 （ p H 1 0 ) で数回洗浄して、 スルファチ ァゾール固定化キトサンビーズ （ C H— G A S T ) を得た。
    [0108] この C H— GA S Tを用いて、 実施例 1 と同様にして丁， Bリンパ球分離操作を行なった。 収率 （ y〉 と純度 （ P 〉 、 および捕捉性 （ S R〉 に関して得られた結果を第】 表に示 比較例 ]
    [0109] 比較のためにリガンドを結合させていないァク リルビ一 ズ （ E C 〉 を用いて、 実施例 1 の手順に従い、 T， Bリン パ球分離橾作を行なつた .， 結果を第 1表に示す。
    [0110] 比較例 2 5 〇
    [0111] 比較のためにリガンドを結合させていないキ卜サンビー ズ （ C H〉 を用いて、 実施例 1 の手順に従い、 Τ , Bリン パ球分離操作を行なった。 結果を第 1表に示す。
    [0112] これらの結果から明らかなように、 免疫グロプリンに高 い親和性を有するリガンドを導入することによって Bリン パ球の捕捉性が著しく向上すること、 それにともない回収 された細胞懸溻液中の Tリンパ球濃度が高まることが確認 された。
    [0113] 実施例 4
    [0114] 実施例 1 と同様にして得られたスルファチアゾ一ル固定 化ァクリルビーズをカラム内に充填した後、 カラム内に 0 . 5 %ゥシ血清アルブミンを注入し、 1 6時間放置後、 カラ ム内の遊離アルブミンを除去した。 このようにしてゥシ血 清アルブミンで処理したスルファチアゾ一ル固定化アタリ ルビーズ （ A E C— S T〉 を用いて、 実施例 1の手順に従 い T ， Bリンパ球分離操作を行なった。 収率 （ y丄、 純度 ( P ) および捕捉性 （ S R》 に関して得られた結果を第 1 表に示す V
    [0115] 第 ]_表に示す結果から明らかように、 アルブミン処理を 施さなかった： E C— S T (実施例 ]_ 〉 と比較して、 分離効 率において純度を低下させることなく 2 ◦ %以上の収率の 向上が観察された。 このことは吸着したアルブミンが Bリ ンパ球一リガンド間の親和性を低下させることなく、 Tリ ンパ球の非特異的付着性を抑制する界面活性剤的効果を発 揮したためと考えられる。 なお、 収率 （ y〉 、 純度 （ p 〉 および捕捉性 ( s R ) は以下のようにして算出された。
    [0116] 回収した処理液中の
    [0117] ， 、 τリンパ球数
    [0118] 収平 （ y ) =注入したリンパ球懸濁液中 x 1 0 0 の τリンパ球数
    [0119] 回収した処理液中の
    [0120] τリンパ球数
    [0121] 純度 ( p ) 二回収した処理液中の X 1 0 0 リンパ球数
    [0122] リカンドを有する分離材への
    [0123] . Bリンパ球吸着率
    [0124] 捕捉性 （ S R〉 二リカンドを持たない分離材への
    [0125] Bリンパ球吸着率
    [0126] 1
    [0127] 0 2 0 3 0 分翻- (%) η%) SR ？ (%) n%) SR Y(¾) SR
    [0128]
    [0129] * (； II (比較咧 2 )においてカラム内に捕捉される Bリンハ がほとんど観察されなかつ たため算出不能であ た..， ？ 、巟
    [0130] o 24 さらに、 本発明に係る T ， Βリンパ球分離材 （実施例 1 〜4 ) においては、 分離材 1 g当り少なく とも 1 . 0 X 1 0 7 〜6 . 0 X 1 0 7 個程度のリンパ球を処理すること if 可能で、 それに要する処理時間が約 2分 Zカラムであり、 しかも生存性、 接着形態の面からみても際だった細胞損傷 も一切ないものであった。
    [0131] 実施例 5
    [0132] P H 7 . 4のリン酸緩衝生理食塩水で 1 0倍希釈して調 製した 5 W/ V %ダルタルアルデヒ ド溶液を用いる以外は、 実施例 3と同様にして架橋タイプのキトサンビーズにスル ファチアゾールをダルタルアルデヒ ドを用いて結合 · 固定 化したスルファチアゾ一ル固定化キトサンビーズ （ C H— G A S T ) を得た。
    [0133] このよ うにして得られた分離材を、 内径 3 画 、 外径 4 雄 のテフロンチュ一ブからなるカラムに充填し、 該チュ一ブ の両端にポリエステル製フ ィルター （ 1 5 0メ ッシュ〉 を 有する端子を接続し、 カラム内に分離材を保持させた。 こ の分離材を充填したカラム内をハンクス緩衝液 （ H B S S ； P H 7 . 2 , C a 2 IV1 g ^フリー〉 で置換し、 続く T -, Bリンパ球分離操作に供した。
    [0134] 一方、 対象とす！）リンパ球を、 ヒ 卜末梢血からフ ィ コ一 ルパック （比重 1 . 0 7 7 、 フアルマシア社製〉 を用いた 比重遠心分離によって採取し、 H B B Sを用いて 8 0 0 X 1 0 4 細胞 Z mlに懸濁 · 希釈することによってリンパ球懸 濁液を調製しだ; - 上記のごとく調製されたリンパ球懸濁液 1 mlをデイスボ
    [0135] 一サブルシリンジとシリンジポンプ （ともにテルモ株式会
    [0136] 社製〉 によって、 第 2表に示す一定流速で、 分離材を充填
    [0137] した上記カラムに注入し、 直ちに H B B Sを用いて第 2表
    [0138] に示す一定流速で同様にカラムに注入してカラム内を洗浄
    [0139] し、 分離操作を完了した。 回収されたリ ンパ球懸濁液の細
    [0140] 胞数を自動血球計数装置 （オルソ イ ンスツルメンッ [OR
    [0141] THO INSTRUMENTS ] 社製， E LT— 8 ) で測定し、 続いて
    [0142] 回収液中の Bリンパ球のみを、 ヒド免疫グロブリンに対す
    [0143] る抗体を結合させた F I TC ('マイルズ [M I LE S ] 社
    [0144] 製) で螢光染色を施し、 螢光顕微鏡によって回収液中の F
    [0145] I TC陽性細胞をカウントし、 F I TC染色細胞 （ F I T
    [0146] C (十》 〉 と F I T C非染色細胞 （ F I T C (—〉 ） が力
    [0147] ラム中に捕捉される割合を求めた。 結果を第 2表に示す。
    [0148] 実施例 6
    [0149] 水不溶性担体としての架橋タイプのキトサンビーズ （ C
    [0150] H ) にリガンドと してァスパラギン酸とフエ二ルァラニン
    [0151] からなるジぺプチドである ' - L - ァスパルチルフェニル
    [0152] ァラニンメチルエステル （ AT、 味の素 （株〉 製） をダル
    [0153] タルアルデヒ ドを用いて結合 ' 固定化した Bリンパ球分離
    [0154] 材を作成した。 なおこの Bリンパ球分離材は C H— G A A - Tと呼称した。
    [0155] まず、 Ρ Η 7. 4のリン酸緩衝生理食塩水 （ P B S〉 で 1 0倍希釈して調製した %ダルタルアルデヒ ド溶液 に、 キトサンビーズを浸して脱気した後、 ブラッ ドミキサ ― (萱垣医理科工業製 ： B M— 1 0 1 ) を用いて室温で撹 ^ 拌した。 蒸留水で洗浄したこの反応物を、 ァスパ ルチルフェニルァラニンメチルエステルをリン酸緩衝生理 食塩水 （ P B S〉 、 p H 7 . 4に溶解させた 0 . 1 M α - L - ァスパルチルフヱ二ルァラニンメチルエステル溶液に 加えて脱気し、 ブラッ ドミキサーで一晩撹拌した。
    [0156] 次に、 このキトサンビーズを洗浄した後、 未反応のアル デヒ ド基をブロッキングするために、 1 Μエタノールアミ ン （ Ρ Η 8〉 溶液中で脱気した後、 ブラッ ドミキサーで一 晚撹拌した。 これを再び蒸留水で洗浄し、 1 W/V %の水素 化ホウ素ナトリウムを含む 1 0 m M塩化カルシウム溶液に 加えて 4。Cで反応させ、 ダルタルアルデヒ ドのアルデヒ ド 基とキ 卜サンおよび" - L - ァスパルチルフヱ二ルァラ二 ンメチルエステルのアミノ基との反応によって生じたァゾ メチン基を還元させて安定化した。 最後に、 蒸留水、 〇 . ' 5 M塩化ナトリゥムを含む 0 . 0 2酢酸緩衝液 （ P H 4 〉 、 および 0 . 2 M炭酸緩衝液 （ P H 〗 0 } で数回洗浄して- -グ ルタルアルデヒ ドを用いて α - L - ァスパルチル フェニル ァラニンメチルエステルを固定化したキ トサンビーズ （ C Η— G A A Τ〉 を得た，
    [0157] このようにして得られた分離材 C H— G A A Tを用いて 実施例 5 と同様にして Τ , B リンパ球分離操作を行なった . 結果を第 2表に示す。
    [0158] 実施例？〜 8
    [0159] 不溶性担体としての架橋タイプのキ卜サンビ一ズ （ C H〉 にリガンドと してスルファチアゾール （ ST〉 または - L - ァスパルチルフヱ二ルァラニンメチルエステル （ AT〉 をェピクロルヒ ドリン （ E H〉 を用いて結合■ 固定化した Bリンパ球分離材を作成した。 なおこの Bリンパ球分離材 はそれぞれ C H— EH ST (実施例 7 ) および C H— E H AT (実施例 8〉 と呼称した。
    [0160] まず、 2 Mの N a〇 Hとェピクロルヒ ドリンを 4 ： 1の 割合で混合し、 蒸留水で 5倍に希釈した溶液にキトサンビ ーズを加え、 ブラッ ドミキサーを用いて 40〜4 5。Cで 2 時間撹拌した。 蒸留水で洗浄したこの反応物を、 DM Fと 1 Om M塩化カルシウム溶液の混液 （ 2 : 3 〉 に溶解させ た〇 . 1 Mスルファチアゾール溶液または P B S ( P'H丁 . 4 ) に溶解させた◦ . 1 - L - ァスパルチルフエニル ァラニンメチルエステル溶液に 0. 1〜0. 7 gZmlの割 合で加えて脱気し、 ブラッ ドミキサ一を用いて室温で一晩 撹拌した。 ' - 次に、 未反応のォキシラン基をブロッキングするために 濃度 1 M ( p H 8 ) のエタノールァミン溶液を添加し、 一 晚撹拌した。 その後、 蒸留水、 塩化ナトリゥム 0 , 5 Mを 含む濃度 0 . 〇 2 M ( P H4 〉 の齚酸緩衝液、 濃度 0. 2 Μ ( ρ Η 1 0 ) の炭酸緩衝液で順次洗浄しスルファチアゾ —ル固定化キトサンビーズ （ C H— E H S T〉 および α - L - ァスパルチルフヱ二ルァラニンメチルエステル固定化 キトサンビーズ （ C Η— E H A Τ〉 を得た。
    [0161] このようにして得られた分離材 C H— E H S Tおよび C H— E HATを用いて、 リンパ球懸濁液注入速度および洗 浄速度を第 2表に示す以外は実施例 5と同様にして T， B リンパ球分離操作を行なった。 結果を第 2表に示す。
    [0162] 比較例 3〜4
    [0163] 比較のために架橋タイァのキトサンビーズ （ C H〉 をそ のまま分離材と して用いて、 第 2表に示すリンパ球懸濁液 注入速度および洗浄速度にて実施例 5と同様にして Τ , B リンパ球分離操作を行なった。 結果を第 2表に示す。
    [0164] 流速 ( ml/h) 捕捉率 (%)
    [0165] FITC FITC
    [0166] 分 離 材 注入 洗净 い） (-)
    [0167] 実施例 5 じ H-GAST 150 120 85 58
    [0168] " 6 - CH-GAAT 150 120 64 8 比較例 3 CH 150 120 37 20 実施例 7 CH-EHST 40 120 78 36
    [0169] ！) 8 CH-EHAT 40 120 77 18 比較例 4 じ H 40 120 61 39 5 S
    [0170] 第 2表に示す結果から明らかなように、 本発明に係る B リンパ球分離材 （実施例 5〜8〉 は、 第 1表に示す結果と 同様に Bリンパ球を優先的に捕捉する分籬材として有効で あることがわかつた。 また、 実施例 5〜8に係る Bリンパ 球分離材においても、 生存性、 接着形態の面からみても際 だつた細胞損傷の一切ないものであった。
    [0171] 実施例 9
    [0172] ポリエチレンォキサイ ド鎖を有するビスエポキシド （ E G 22 , ナガセ化成工業 製〉 （エチレンオキサイ ド躁返 し度 22 ) をスぺーサ一として用い、 ォキシラン基を有す るァクリルビーズ （オイパーギッ ト C ( EC ) 、 レーム フアルマ [Rohm Pharma ] 社製〉 （平均粒径 0. 15丽 〉 にリガンドと して複素環式化合物であるスルファチアゾ一 ル （ ST〉 を結合 · 固定化して Bリンパ球分離材を作成し た。 なおこの Bリンパ球分籬材は EC— EG 22 STと呼 称した。
    [0173] まず、 炭酸緩衝液 （ P H 1 0 ) に溶解した 0. 21 の 1 ，3-プロパンジアミン溶液に、 蒸溜水で予め洗浄した EC
    [0174] 30 を加え脱気した後、 8 CTCの水洛中で 3時間反--応 させた。 そしてブラッ ドミキサー （萱垣医理科工業眯製， B M - 1 0 1 ) を用いて室温にて一晩撹拌し、 蒸留水で洗 浄した 次に、 このようにしてアミノ基を導入した EC 18 ir (湿潤重量） を.、 炭酸緩衝液 （ Ρ Η Γ0》 を用いて 作成した 10 % ( w/v ) E G 22溶液に加え、 全量を 1 0 ◦ mlと し、 ブラッ ドミキサーで一晩回転混合した後、 8 0 。Cの水浴中で 1時間反応させ、 蒸留水で洗浄した。 これを 再び炭酸緩衝液 〈 P H 1 0 ) とジメチルホルムアミ ドの混 合液 （容量比 2 ： 3 ) を用いた 0 · 1 Mスルファチアゾー ル溶液〗 0 0 ml中に加え、 8◦ の水浴中で 3時間反応さ せ、 ブラッ ドミキサーで一晩回転混合した。 さらに、 未反 応のォキシラン基をブロッキングするために、 濃度 1 M
    [0175] ( P H 8 ) のェタノ一ルアミン 1 0 0 mlを添加し、 ー晚撹 拌した。 その後、 蒸留水、 塩化ナトリウム◦ . 5 Mを含む 濃度 0 . 0 2 M ( p H 4 〉 の酢酸緩衝液、 濃度 0 . 2 M
    [0176] ( P H 1 0 ) の炭酸緩衝液で順次洗浄し、.ポリエチレンォ キサイ ド鎖を介してスルファチアゾールを固定化したァク リルビーズ （ E C— E G 2 2 S T ) を得た。
    [0177] このようにして得られた分離材を、 内径 3 聽 、 外径 4 画 のテフ口ンチューブからなるカラムに充填し、 該チューブ の両端にボリエステル製フ ィルター （ 1 5 0メ ッシュ） を 有する端子を接続し、 カラム内に分離材を保持させた。 こ の分離材を充填したカラム内をハンクス緩衝液 （ H B S S ； P H 7 . 2 , C a 2 , M g £ ÷フリー） で置換し、 続く Ίヽ Bリンパ球分離操作に供した。
    [0178] 一方、 対象とするリンパ球を、 ヒ ト末梢血からフ ィ コ一 ルパック （比重 1 . 0 7 7 、 フアルマシア社製〉 を用いた 比重遠心分離によつて採取し 、 H B B Sを用いて 8 0 〇 X 1 〇 4 細胞 Z mlに懸濁 · 希釈することによってリンパ球懸 溻液を調製した。
    [0179] 上記のごとく調製されたリンパ球懸溻液 1 mlをデイスボ 一サブルシリンジとシリンジポンプ （ともにテルモ株式会 社製〉 によって、 第 3表に示す一定流速で、 分離材を充填 した上記カラムに注入し、 直ちに H B B Sを用いて第 3表 に示す一定流速で同様にカラムに注入してカラム内を洗浄 し、 分離操作を完了した。 回収されたリンパ球懸濁液の細 胞数を自動血球計数装置 （オルソ イ ンスツルメンッ [OR THO INSTRUMENTS ] 社製， E LT— 8 ) で測定し、 続いて 回収液中の Bリンパ球のみを、 ヒ ト免疫グロプリンに対す る抗体を結合させた F I TC. (マイルズ [M I LE S ] 社 製〉 で螢.光染色を施し、 螢光顕微鏡によって回収液中の F I T C陽性細胞をカウントし、 F I TC染色細胞 （ F I T C (十） ) と F 1 T C非染色細胞 （ F I T C ( - 〉 〉 が力 ラム中に捕捉される割合を求めた。 結果を第 3表に示す。 比較例 5
    [0180] 比較のために、 ォキシラン基を有するアクリルビーズ (オイバーギッ ト C ( EC ) 、 レーム フ アルマ社製〉'を そのまま分離材と して用いて、 実施例 9の手順に従い、 T, Bリンパ球分離操作を行なった。 結果を第 3表に示す。
    [0181] 実施例 1 0
    [0182] ポリエチレンォキサイ ド鎖を有するビスェボキシド （ E G 22 , ナガセ化成工業㈱製〉 をスぺ サ一と して用い、 架橋タイアのキトサンビーズ （ch opearl ( CH ) 、 富士 紡績㈱社製〉 （平均粒径 0 · 3 廳 ） にリ力'ンドと してスル ファチアゾ一ル （ S T〉 を結合 · 固定化して Bリンパ球分 離材を作成した。 なおこの B リンパ球分離材は C H— E G 2 2 S丁と呼称した。
    [0183] まず、 予め蒸留水で洗浄した 3 0 g (湿潤重量〉 のキト サンビーズを、 炭酸緩衝液 （ P H 1 0 ) を用いて調製した 1 0 % ( W/V ) E G 2 2溶液に加え、 全量を 1 0 O mlと し、 ブラッ ドミキサ一で一晩回転混合した後、 8 0 °Cの水洛中 で 1時間反応させ、 蒸留水で洗浄した。 これを再び炭酸緩 衝液 （ P H 1 0〉 とジメチルホルムアミ ドの混合液 （容量 比 2 ： 3 ) を用いた 0 . 1 Μスルファチアゾ一ル溶液 1 0 ◦ ml中に加え、 8 0 °Cの水浴中で 3時間反応させ、 ブラッ ドミキサーで一晩回転混合した。 さらに、 未反応のォキシ ラン基をプロッキングするために濃度 1 M ( P H S ) のェ タノ一ルアミン 1 0 0 mlを添加し一晩撹拌した。 その後、 蒸留水、 塩化ナトリウム 0 . 5 Mを含む濃度 0 . 0 2 M
    [0184] ( P H 4 の酢酸緩衝液、 濃度◦ . 2 Μ ( ρ Η 1 ◦ 〉 の炭 酸緩衝液で順次洗浄し、 スルファチアゾールを固定化した キトサンビ一-ズ （ C Η— E G 2 2 S Τ〉 を得た。
    [0185] このようにして得られた分離材 C Η - E G 2 2 S Τを用 いて、 実施例 9と同様にして Τ , Β リンパ球分離操作を行 なった > 結巣を第 3表に示す。
    [0186] 比較例 6
    [0187] 比較のために架橋タィァのキ 卜サンビーズ （ c h i t opea I . ( C H ) 富士紡績㈱社製） をそのまま分離材として用いて 実施例 9の手順に従い、 T . Bリンパ球分離操作を行なつ た。 結果を第 3表に示す。
    [0188] 第 3表 流速 （ ml/h) 捕捉率 ）
    [0189] FITC FITC
    [0190] 分 離 材 汪入 浄 (+ ) (-)
    [0191] 実施例 9 EC-EG22ST 2 60 66 6
    [0192] ϋ ο
    [0193] 比較例 5 .EC 60 92 86
    [0194] 実施例 10 CH-EG22ST 20 60 75 7
    [0195] 比較例 6 CH 20 60 67 52
    [0196] 第: 3表に示す結果から明らかなように、 各分離条件にお いて、 スベーサ一を介してスルファチアゾ一ルを結合した 分離材 （実施例 9〜 1 0 ) は、 リンパ球そのものの接着性 を著しく低下させるとともに、 Βリンパ球に対する高い親 和性を損なうことなく Τリンパ球の非特異的接着を抑制し 高精度な Τ , Βリンパ球選択性を有するものであった。 らにこのような高度の選択性の発現は、 水不溶性固体物質 がァクリルビーズ （ E C ) である場合でもキトサンビ一ズ ( C H } である場合でも観察され、 Τ , Bリンパ球選択性 は水不溶性固体物質の種類に依存しないことが確認された 実施例 1 1〜 1 2
    [0197] スぺーサ一と してエチレンォキサイ ドの繰返し度が 1の エチレンォキサイ ド鎖を有するビスエポキシド （ E G 1 ， ナガセ化成工業㈱製〉 （実施例 1 1 ) または繰返し度が 9 のビスエポキシド （ E G 9 , ナガセ化成工業㈱製〉 （実施 例 1 2 〉 を用いる以外は実施例 9と同様にしてエチレンォ キサイ ド鎖を介してスルファチアゾ一ルを固定化したァク リルビーズを作成した。 なお得られた Bリンパ球分離材は それぞれ E C— E G 1 S T (実施例 1 1 〉 、 E C— E G 9 ST (実施例 1 2 〉 と呼 した。
    [0198] この分離材 E C— E G 1 STまたは E C— E G 9 STを 用いてリンパ球懸濁液注入速度および洗浄速度を第 4表に 示す速度とする以外は実施例 9と同様にして、 Τ , Bリ'ン パ球分離操作を行なった。 結果を第 4表に示す。
    [0199] 実施例 1 3
    [0200] 実施例 9と同様にして E C— E G 2 2 S Tを作成し、 こ の分離材を用いてリンパ球懸濁液注入速度および洗浄速度 を第 4.表に示す速度とする以外は実施例 9と同様にして、 Τ , Bリンパ球分離操作を行なっ 。 結果を第 4表に示-す 実施例 1 4〜： L 5
    [0201] スぺ一サ一と してメチレンの繰返し度が 4の 1 , 4 ブタ ンジォ一ルジグリシジルエーテル （ M E 4 , 東京化成眯製〉 (実施例 1 4 ) またはメチレンの繰返し度がらの 1,6 - へ キサンジ才一ルジグリシジルェ一テル （ M E 6 , 東京化成 ㈱製〉 （実施例 1 5 ) を用い、 その溶液として炭酸緩衝液 ( P H 1 0 ) とジメチルホルムアミ ドの混合液 （容量比 9 ： 1 〉 を用いて調製した 1 ◦ ( W/V ) %ME 4溶液、 炭酸緩 衝液 （ p H 1 ◦ ) 、 ジメチルホルムアミ ドおよび蒸留水の 混液 （容量比 2 : 2 : 1 ) を用いて調製した 1 ◦ ( W/V ) %ME 6溶液とする以外は実施例 9と同様にしてポリェチ レン鎖を介してスルファチアゾールを固定化したァクリル ビーズを作成した。 なお得られた Bリンパ球分離材はそれ ぞれ E C— M E 4 S T (実施例 1 4 ) 、 E C— ME 6 ST (実施例 1.5 ) と呼称した。
    [0202] この分離材 E C— ME 4 STまたは EC—ME 6 STを 用いてリンパ球懸濁液注入速度および洗浄速度を第 4表に 示す速度とする以外は実施例 9と同様にして、 Τ , Bリン パ球分離操作を行なった。 結果を第 4表に示す。
    [0203] 第 -4. 表 流速 レ 〉 捕 捉 率 （ % ) 分 お hi 注 入 洗 FITC ( + ) FITCH
    [0204] 60 91 57
    [0205] 60 85 12
    [0206] 60 85 6
    [0207] 120 67
    [0208] I 20 96 62
    [0209] 第 4表に示す結果から明らかなように、 スぺ一サを介し てスルファチアゾールを結合した分離材は、 Bリンパ球に 対する高い親和性を損なうことなく Tリンパ球の非特異的 接着を抑制し、 高精度な Τ , Bリ ンパ球分離能を維持する ことがわかり、 特に E G 9 (実施例 1 2 ) 、 E G 2 2 (実 施例 1 3 ) および ME 4 (実施例 1 4 ) をスぺ一サと して 用いたものは際だった Τ , B選択性を示した。
    [0210] 実施例 1 6
    [0211] スぺ一サ一と してエチレンォキサイ ドの繰返し度が 1の エチレンォキサイ ド鎮を'有するビスエポキシド （ EG 1、 ナガセ化学工業 （株〉 製〉 用い、 その溶液と して炭酸緩衝 液 （ P H 1 ◦ ) とジメチルホルムアミ ドの混液 （容量比 9 ： 1 ) を用いて調製した 1 0 ( W/V) E G 1溶液とする以外 は実施例 1 0と同様にして、 エチレンォキサイ ド鎖を介し てスルフ ァチアゾ一ルを固定化したキトサンビ一ズを作成 した。 なお得られた Bリ ンパ球分離材は C H— E G 1 S T と呼称した。
    [0212] この分離材 C H— E G 1 STを用いてリンパ球懸濁液注 入速度および洗浄速度を第 5表 fc示す速度とする以外 yr^ 施例 1 0と同様にして Τ , Bリンパ球分離操作を行なつた。 結果を第 5表に示す。
    [0213] 実施例〗. 7
    [0214] スぺ一サ一と してエチレンォキサイ ド鎖を 3本有する 3 官能性の卜リェボキシ ド （ E G 3、 ナガセ化成工業 （株） 製） を用いる以外は、 実施例 1 0 と同様にしてエチレンォ キサイ ド鎖を介してスルファチアゾ一ルを固定化したキト サンビーズを作成した。 なお得られた Bリンパ球分離材は C H— E G 3 S Tと呼称した。
    [0215] この分離材 C H— E G 3 S Tを用いて、 リンパ球懸濁液 注入速度および洗浄速度を第 5表に示す速度とする以外 ί 実施例 1 0と同様にして T ， Bリンパ球分離操作を行なつ た。 結果を第 5表に示す。
    [0216] 実施例 1 8
    [0217] スぺ一サ一と してエチレンォキサイ ドの繰返し度が 9の ポリエチレンォキサイ ド鎖を有するビスェポキシド （ E G 、 ナガセ化成工業 （株〉 製〉 を用いる以外は実施例.1 〇 と同様にして、 ポリエチレンォキサイ ド鎖を介してスルフ ァチアゾ一ルを固定化したキトサンビーズを作成した。 な お得られた Bリンパ球分離材は C H— E G 9 S Tと呼称し た。 ' この分離材 C H - E G 9 S Tを用いて、 リンパ球懸濁液 注入速度および洗浄速度を第 5表に示す速度とする以外は 実施例 1 0と同様にして、 T ， Βリンパ球分離操作をネ亍-な つた。 結果を第 5表に示す。
    [0218] 実施例 1 9
    [0219] 実施例 1 0と同様にして C Η - - E G 2 2 S Τを作成し、 この分離材を用いて、 リンパ球懸濁液注入速度および洗浄 速度を第 5表に示す速度とする以外は実施例 1 0と同様に して T , Βリンパ球分離操作を行なった。 結果を第 5表に 示す。
    [0220] 実施例 2 0〜2 1
    [0221] スぺ一サと してメチレンの繰返し度が 4の 1,4 - ブタン ジォ一ルジグリシジルエーテル （ ΜΕ 4、 東京化成 （株〉 製〉 （実施例 2 0 ) またはメチレンの綠返し度が 6の 1，S -へキサンジオールジグリシジルエーテル （ ME 6 , 東京 化成 （株〉 製〉 （実施例 2 1 ) を用い、 その溶液と して炭 酸緩衝液 （ P H 1 0〉 を用いて調製した 1 ◦ ( W/V)%ME - 4溶液、 炭酸緩衝液 （ P H 1 0 〉 、 ジメチルホルムアミ ド および蒸留水の混合液 （容量比 2 : 2 : 1 ) を用いて調製 した 1 0 ( W/V ) %ME 6溶液とする以外は実施例 1 ◦と 同様にして、 ポリメチレン鎖を介してスルファチアゾ一ル を固定化したキトサンビーズを作成した。 なお得られた B リンパ球分離材はそれぞれ C H - M E 4 S T (。実施例 2 0 ) 、 C H - M E 6 S T (実施例 2 1 〉 と呼称した。
    [0222] この分離材 C H— M E 4 S Tまたは C H— M E 6 S Tを 用いて、 リンパ球懸濁液注入速度および洗浄速度を第 5表 に示す速度とする以外は実施例 1 0と同様にして、 Τ , -B リンパ球分離操作を行なった。 結果を第 5表に示す。 第 —5 一表 流速 （ml/h〉 捕 捉 率
    [0223] 分 ヽ
    [0224] 注 入 ¾ ϋ Fire (+) nic (-)
    [0225] CII-FG1SI ξΗ\ CllCl 2 じ l 0), -CH2 圆 2 -si 40 1 20 . 68 1
    [0226] )11
    [0227] OH
    [0228] a;v ...N/CII2 CH2 ϋ-じ H2 CllCl -Si
    [0229] CII-IG3SI CIICH2 - ϋじ ll2 じ ll2 >ϋ 40 120 90 21
    [0230] )11 —― N"¾l2 じ H20-CH2 CHCH2 ST
    [0231] I a cn-ra i @H:H 2 -SI ] 5 1 20 SO 20
    [0232]
    [0233] 一 _
    [0234] 9 IG SI 2 - ()(じ H 2 CH2.0)22 -じ H2 -Si 1 2 60 79 cii-Mi isi 2 elicit -o(cn 2 ) Λ -en 2 cncn2 - s丁 40 】 20 80 4
    [0235] on on
    [0236] 、
    [0237] II-MIGS! φΐ (;ΐΙ 2 2 ) CH 2 CIICH2 -SI 40 120 79 8
    [0238]
    [0239] 7〇
    [0240] 第 5表に示す結果から明らかなように、 スべ一サーを介 してスルファチアゾールを結合した分離材は、 第 5表に示 す結果と同様に、 Bリンパ球に対する高い親和性を損なう ことなく Tリンパ球の非特異的接着を抑制し、 高精度な T， Βリ ンパ球分離能を維持することがわかり、 特に E G 22 (実施例 1 9 ) 、 ME 4 (実施例 20 〉 および M E 6 (実 施例 2 1 ) をスぺーサと して用いたものは、 1 ◦ %に満た ない F I TC (—） の捕捉率と F I TC (十〉 'の捕捉率が S 0 %という際だった選択性を示した。
    [0241] 実施例 22〜2 5
    [0242] 比重遠心分離法によってヒ ト抹消血より得られたリンパ 球分画には主として Tリンパ球および Bリンパ球の他、 単 球あるいはヌル細胞等の不純物が存在することから、 これ らの非 T， Βリンパ球系細胞 （ Ν〉 の混入をペルォキシダ ーゼ染色法、 ィムノビーズ法によって評価した。 すなわち、 実施例 9と同檨にして得られた E. C -- E G 2 2 ST、 実施 例 1 0と同様にして得られた C H - E G 2 2 S T、 実施例 2 0と同様にして得られた C H— ME4 S T、 または実施 例 2 1と同様にして得られた C H— ME 6 S Tを用いて： リンパ球懸濁液の注入速度および洗浄速度を第 6表に示す 速度で行なう以外は実施例 9と同様にして Τ , Bリンパ球 分離:橾作を行ない、 分離-操作前後のリンパ球懸濁液中の非 T， Bリンパ球系細胞 （ N ) の混入の割合を上記方法によ り評価し、 さらに分 II操作によつて回収された Tリンパ球 の収率および純度を上記の評価方法から算出し、 正確な分 離精度を得た。 結果を第 6表に示す。
    [0243] 6 カラムに注入したリンパ球分画中の細胞比 （％ )
    [0244] To Bo No
    [0245] 10〜20 15
    [0246] X 2
    [0247] 分 離 材 流速 iL i) カラムに捕捉された割合 ) 回収 T リ ンパ球
    [0248] 注入 洗^ Τ/Το ― B/Bo N/N0 _ 純度は） 収率 ） 難 (列 22 l:0-FG223T 12 60 20± 3 84士 7 54士 8 89± 2 801- 12 " 2 3 CII-EG2 622SF 12 60 20±12 84±10 73土 2 89 ± 4 90土 13 » 24 CH"HF4S 5i 40 120 20土 3 89 ± 4 83± 8 94± 1 821 5 " 2 5 CII-Hl-GST一 7 5 40 120 17:ヒ 5 90 ± 3 8 ±15 94土 2 85 2
    [0249] To , o 、 NOはそれぞれリンパ球分雨中に含まれる Tリンパ球、 Βリンパ球、 非 Τ , 1 リンノヽ。球の初期値を表わすものである
    [0250] Τ/'ΤΟ 、 Β / Β 0 '、' Ν 0 はそれぞれ分離橾作後の回収リンパ球分画中に含ま れる Τリンパ球、 Βリンパ球、 非 Τ, Βリンパ球の値から逆算された捕捉 Τリンパ 球 （ Τ ) 、 捕捉 Βリンパ球 （ Β ) 、 捕捉非 Τ . Βリンパ球 （ Ν ) の腈をそれぞれの 初期 ί|ί·ίΤθ , BO , NO で除して得られた値である。
    [0251] 5
    [0252] 第 6表に示す結果から明らかなように、 本発明に係る T , Bリンパ球分離材はいずれも極めて高い T， Bリンパ球選 択性を有し、 Tリ ンパ球の収率、 純度もそれぞれ 80〜9 5 %、 9 0〜 9 5 %という際だった値が示され、 またこの 様な分離能は非 Τ , B系細胞の混入にも影響されないこと が同時に確認された。
    [0253] 実施例 2 6〜28
    [0254] まず実施例 1 6と同様にして C H— E G 1 STを、 実施 例 1 8と同様にして C H— E G 9 S Tを、 および実施例 1 〇と同様にして C H— E G 2 2 STを作成した。
    [0255] これらの分離材を用いて、 第 7表に示すリ ンパ球懸濁液 注入速度および洗浄速度にて実施例 9における手順に従い、 ラッ 卜腸間膜リンパ節から調製されたリンパ球懸澍液.およ びヒ ト末梢血リンパ球懸濁液に対して T , 8リンパ球分離 操作を行なった。 なおラッ ト由来のリンパ球の蛍光染色に はラッ ト免疫グロプリン Gに対する抗体を結合させた F I TCを用いた。 結果を第 7表に示す。
    [0256] 4
    [0257] 第 7表
    [0258] ί、 m Ulll / /h 11) / 捕捉率 ）
    [0259] FITC FITC
    [0260] 分 離 材 注入 洗浄 い） (-)
    [0261] フ ッ 卜
    [0262] 実施例^ CH -EG1ST 40 120 67 15
    [0263] " 27 CH -EG9ST 40 120 62 16
    [0264] " 28 CH -EG22ST 40 120 64 13
    [0265] ヒ 卜
    [0266] 実施例 26 DH -EG1ST 20 60 86 28
    [0267] 〃 11 CH -EG9ST 2ひ 60 63 16
    [0268] n 28 CH -EG22ST 20 60 69 7
    [0269] 第 7表に示す結果から明らかなように、 本発明に係る T Bリンパ球分離材はいずれもラッ トおよびヒ卜由来のリン パ球に対して極めて高い Bリンパ球親和性を有することが 示された。 このことから免疫グロプリン Gに対して親和性 を有するリガンドをスベ一サーを介して固定した本発明の T， Bリンパ球分離材は、 分離するリンパ球の動物種に影 響されない B リンパ球親和性を有するでおろうことが推定 された，
    [0270] さらに本発明に係る Τ , Bリンパ球分離材 （実施例 9〜 2 8 ) においては、 分離材 1 g 当り少なく とも 1 ■ 0 X 1 07 〜6 . 0 X 1 07 個程度のリンパ球を処理するこヒが 可能で、 それに要する処理時間が 1 ◦分以内であり、 しか も生存性、 接着形態の面からみても際だった細胞損傷も一 切ないものであった。
    [0271] 実施例 2 9
    [0272] まず、 0 . 1 Mリン酸緩衝液 （ P H 7 . 4 ) にダルタル . アルデヒ ドを 5 ( /V ) %濃度となるように溶解した。 こ のダルタルアルデヒ ド溶液にキトサンビーズ （富士紡績製、 キ卜パール B CW 3 0 0 3、 ロッ 卜ナンバー H— 0 1 3 2 〉 を 0. 2〜0 . 4 g (湿潤重量〉 Zmlの割合で加え.、 脱気した後に、 ブラッ ドミキサー （萱垣医理科工業製、 B IV！— 1 0 1型） を使用して室温にて一晩攪拌した。 次に、 得られた反応物を蒸留水で洗浄した後、 0 . 1 M炭酸緩衝 液 （ P H 1 0 〉 に溶解した 0 . 0 5 IV1ァスパルチルフ ヱニ ルァラニンメチルエステル （味の素製、 商品名 ： ァスパル テーム） の溶液を加えて脱気し、 ブラッ ドミキサーを使用 して室温で一晩攪拌した。 そして、 蒸留水で洗浄した後、 未反応のアルデヒ ド基をプロッキングするために、 1 Mモ ノエタノ一ルァミ ン' （ P H 8. ◦ 〉 を添加して脱気し、 ブ ラッ ドミ キサーで一晩攪拌した。 これを蒸留水で洗浄した 後に 1 ( W/V ) %水素化ホウ素ナト リウムの ϋ . 1 Μリン' 酸緩衝液 （ Ρ Η 7 . 4 ) 溶液に浸して室温にて 3時間と き どき撹拌を加えながら反応させた。 この反応によつてグル 7 ら
    [0273] タルアルデヒ ドのアルデヒド基と、 キトサンおよびァスパ ルチルフヱ二ルァラニンメチルエステルのアミノ基との反 応によって生じたァゾメチン結合を還元させて安定化させ た。 さらに、 蒸留水、 0 . 5 M塩化ナトリゥムを含む P H 4 . 0、 0 . 0 2 M酢酸緩衝液、 P H 1 ◦、 0 . 2 M炭酸 緩衝液で繰り返し洗浄して浄化材を調製し以下の吸着実験 に供した。 吸着実験はまず、 ガラス製試験管 （テルモ製、 ラルボ） に上記で得られた浄化材 1 g (湿潤重量） と抗凝 固剤と して C P D液 1 4◦ Jl Z mlを添加した正常人血漿 5 mlを入れ、 脱気後、 ブラッ ドミキサーを用いて攪拌しな がら、 3 7 Cの熟風循環式恒温槽 （田葉井製、 P ( S ) — 2 1 2型；） で 9◦分間ィンキュベートを行なった。 所定時 間経過の後、 ポリエステルメッシュ （ 2 2 5メッシュ） を 用いて沪過した後、 沪液中のアルブミン量と総タンパク量 をそれぞれブロムクレゾールグリーン （ B C G〉 法、 ピウ レッ ト法により測定した。 また、 グロブリ ン量は、 総タン パク量どアルブミン量との差とじて求めた。 即ち、 フイブ リノ一ゲンも便宜上グロブリンに含めて計算した。
    [0274] これとは別に浄化材を添加しないで上記と同檨の操作 - (ブランク ） を行ない、 同様にアルブミ ン置、 グロブリ ン 量を測定算出した。 ブランクのアルブミ ン量、 グロブリ ン 量から前記浄化材を用いた場合のアルブミン量、 グロプリ ン量をそれぞれ差し引くことにより吸着量を算出し、 さら にこの値で前記浄化材を用いた場合の値を除することによ りおのおのの吸着率を算出した。
    [0275] さらに前記操作において得られた 液中の I g G、 I g
    [0276] Mの量を一元放射免疫拡散法 （ S R I D ) にて測定し上記 と同様にブランクの値から差し引くことにより I g G、 I gMの吸着量を、 またこの値で除することにより I g G、,. I gMの吸着率を求めた。 これらの結果を第 8表に示す。 比較例？〜 8
    [0277] 〇 . 1 M炭酸緩衝液 （ P H 1 0 〉 に溶解した 0. 0 5 M ァスパルチルフエ二ルァラニンメチルエステルの溶液を用 いる代わりに、 同じく 0. 1 M炭酸緩衝液 （ p H 1 ◦ 〉 に 溶解した 0. 1 Mァスパラギン酸 （比較例 7 〉 または◦ .
    [0278] 1 Mフエ二ルァラニン （比較例 8 ) の溶液を用いる以外 実施例 2.9と同様にして浄化材を調製し同様の吸着実験に 供した。 結果を第 8表に示す。
    [0279] 比較例 9
    [0280] キ トサンビーズ （富士紡績製、 キ卜パール B C 3 0 0 3、 Ώッ 卜ナンバー H— 0 1 3 2 ) をそのまま浄化材と し て用いて実施例 2 9と同様の吸着実験に供した。 結果を第
    [0281] 8表に示す。 -
    [0282] 一 | 表 ill リ ガ ン ド _____
    [0283] ii ''d キ卜パール ァスノ ルチルフエニル 27.8 42.3 21.0 2.1 18.0 35.3 41.0 30.0 ァラニンメチルエスデ レ
    [0284] キ卜パ、—'ル ァスパラギン酸 29.1 35.9 18.0 1.5 18.9 30.0 36 21.0 l|7l! |< キトパール フエニルァラ二-ン' 28.3 44.9 20.0 1.2 18,3 37.5 38.0 17.0 キ j、パーリレ B.2 40.7 18.0 1.0 17.0 34.0 36,0 14.0
    [0285] BCW303
    [0286] Alb. 、 は、 それぞれァノレブミン、 グロブリンを表わ
    [0287] I叹 n'. r実' に I ' り ί uた,:ヒ卜 I ΙUίΐLΐϋ¾ί¾'中 11 ^のj-各-蛋 I；' j遭 tの初 v期jw濃m^,、 fれぞれアルブミン 38, 88卿/1)|1、 グロブリン29. ( ) IIKJ (II I、 I C! 10. 3 ( ) (IH) ill I . 1 g M 1. iiig/m Iであつた o
    [0288] 第 8表に示す結果から明らかなように、. 担体であるキト サンビーズ表面にジぺプチドであるァスパルチルフェニル ァラニンメチルエステルを固定化してなる本発明に係わる 浄化材 （実施例 2 9 ) はリガンドと してアミノ酸を用いた もの （比較例 7〜8 ) およびキトサンビーズそのものを浄 化材と して用いたもの （比較例 9 ) と比較して明らかに ェ g Gおよび I g Mをより選択的に吸着することが示された。 実施例 3 0
    [0289] ァスパルチルフェ二ルァラニンメチルエステルを用いる 代わりに、 グルタミン酸とフヱ二ルァラニンのジぺプチド ( a - L ~グルタミル— L —フヱ二ルァラニン、 国産化学 製〉 を用いる以外は実施例 2 9と同様にして浄化材を調製 し、 同様の吸着実験に供した。 結果を第 9表に示す。
    [0290] 実施例 3 1
    [0291] ァスパルチルフェニルァラニンメチルエステルを用いる 代わりに、 ァスパラギン酸と トリプトファンのジぺプチド ( L— ト リフ。トフ ィルー L —ァスパラチック アシッ ド、 国産化学製〉 を用いる以外は実施例 2 9と同様にして浄化 材を調製し、 同様の吸着実験に供した。 結果を第 9表に示 す。
    [0292] 比較例 1 ϋ〜 1 3
    [0293] ァスパルチル フヱ二ルァラニンメチルエステルを用いる 代わりに、 グルタミン酸 （比較例 1 0 ) 、 ァスパラギン酸 (比較例 1 ]. 〉 、 フエニルァラニン （比較例 1 2 〉 または s 〇
    [0294] トリプトファン （比較例 1 3 ) を用いる以外は実施例 2 9 と同様にして浄化材を調製し同様の吸着実験に供した。 結 果を第 9表に示す。
    [0295] なお、 実施例 2 9および比齩例？〜 9の淨化材に対する 吸着実験と、 実施例 3 0 - 3 1および比較例 1 0〜 1 3:.の 浄化材に対する吸着実験とは、 それぞれ別個の正常人個体 からの血漿に対して行なわれた。
    [0296] o 1
    [0297] キキキキキ
    [0298] ノノノノ 3： W：ノ w： W：：：ノ
    [0299] 333ヽ Vヽヽ o o。 fl»
    [0300] ルル 333ル M ,吸
    [0301] 吸 丄 ng/Zg ) 吸 /0 )
    [0302] ) ガ ソ
    [0303] 43.5 14.0 18 18 ，リ
    [0304] L フエニルァラニン ' LL.0
    [0305] .' 卜リブ'卜フィル 26. G 41.7 23. B 1.5 18.2 32.2 49.4
    [0306] '- ァスパラティックァシッ H 18.6 グルタミン酸 28.9 33.6 22.0 19. δ 26.4 17.0 ァスパラギン酸 ： . ι 33. b 21.3 1.8 21.3 2f).9 4/1.7 23.0 フエニルァラニン 2 8 41.9 22.2 1.5 18.4 32.3 Ί6.4 18.6
    [0307] Jl: 卜リフ Ί、ファン 4 .9 21.8 1.1 17.1 33.2 45.5 13.2
    [0308] り ミン29■ 2 グロプリン' 25
    [0309] 第 9表に示す結果も第 8表に示す結果と同様に、 担体で あるキトサンビーズ表面にジぺプチドである - L—グル タミル一 L—フヱ二ルァラニン （実施例 3 0 ) あるいは丄 —トリプトフ ィル一 L—ァスパラチック ァシッ ド （実施 例 3 1 〉 を固定化してなる本発明に係わる浄化材はリガン ドと してアミノ酸を用いたもの （比較例 1 ◦〜 1 3 ) と比 較して明らかに I g Gおよび I g Mをより選択的に吸着す ることを示すものであった。
    [0310] [産業上の利用可能性]
    [0311] 以上述べたように、 本発明は、 水不溶性固体物質表面に 免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成されたリガ ンドを固定化したことを特徴とする Bリンパ球分離材であ るから、 Bリンパ球'のみを選択的に捕捉分離でき、 例えば 末梢血あるいは生体組織から得られるリンパ球分画から、 Tリンパ球と Bリンパ球を簡便かつ迅速に高収率、 高純度 で分離することが可能であり、 しかも分離された Tリンパ 球および B リンパ球の機能的損傷も少ないことから、 免疫 機能に関係した疾患の診断、 治療やリンパ球由来の生理话 / 性物質を得るための基礎技術に応用できるものである： さ ' らに本発明の B リンパ球分離材において、 有機合成された リガンドが、 複素環式化合物類、 ペプチド類およびアミノ 酸類からなる群から選ばれたものである場合、 より望まし ヽは複素環式化合物類が、 化学療法剤およびその誘導体 ピリ ミジン関連化合物、 ピリジン '関違化合物ならびにビラ S 3
    [0312] ジン関連化合物からなる群から選ばれたもの、 さらに望ま しくは複素環式化合物類が、 サルファ剤、 サルファ剤と P K 4 . 0〜9 . ◦の色素との化合物、 2 - チォゥラシル、 イソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミノ一ルからなる群か ら選ばれたものであり、 また望ましくはべプチド類がアミ ノ酸数 2〜 1 0程度のオリゴペアチド、 さらに望ましくは オリゴペプチドが、 リジン、 チロシンによるオリゴぺプチ ドあるいはァスパルチルファニルァラニンアルキルエステ ルであり、 また望ましくはアミノ酸類がバリン、 ロイシン、 チロシン、 フエ二ルァラニン、 イ ソロイ シン、 トリプトフ アン、 リジン、 アルギニン、 プロリンおよびァスパラ.ギン 酸ないしその誘導体からなる群から選ばれたアミノ酸を単 独あるいは複数組合せたものである場合、 あるいはまた有 機合成されたリ—ガンドが、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 フエ二ルァラニン、 プロリンとスルファチアゾ一ルを組合 せてなるものである場合、 よ り高純度、 高収率で安全性高 く Tリンパ球および Bリンパ球を得ることができるものと なり、 さらに、 水不溶性固体物質が平均粒径 0 . 0 5〜5 誦の粒子休であり、 有機合成されたリガンドが、 水不溶性 固休表面に共有結合により固定化されているものであると より安定化して効率よく Bリンパ球を分離することが可能 となる。
    [0313] また本発明は、 水不溶性固体物質表面に免疫グロプリン と高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化し てなる分離材に、 Bリンパ球含有液を接触させ、 膜表面に 免疫グロプリン分子 （ S— I g〉 を有する Bリンパ球を選 択的に捕捉せしめることを特徴とする Bリンパ球の分離方 法であるから、 濃厚血清や生理话性物質を用いることなく 簡便に精度の高い Bリンパ球分離を行なうことができ、 さ らに本発明の Bリンパ球の分離方法において、 分離材に固 定化されたリガンドが、 複素環式化合物類、 ペプチド類お よびアミノ酸類からなる群から選ばれたものである場合、 より望ましくは複素環式化合物類が、 化学療法剤およびそ の誘導体、 ピリミジン関連化合物、 ピリジン関連 匕合物な らびにピラジン鬨連化合物からなる群から選ばれたもの、 さらに望ましくは複素環式化合物類が、 サルファ剤、 サル ファ剤と ρ Κ 4 . 0〜9 · ◦の色素との化合物、 2 - チォ ゥラシル、 ィ ソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミノールか らなる群から選ばれたものであり、 また望ましくはべプチ ド類が、 アミノ酸数 2〜 1 0程度のオリゴペプチド、 さら に望ましくはォリゴぺプチドが、 リジン、 チロシンによる ォリゴぺプチドあるいはァスパルチルフヱ二ルァラニンァ ルキルエステル、 また望ましくはアミノ酸類が、 バ、 J ン ί ロイ シン、 チロシン、 フエ二ルァラニン、 イ ソロイ シン、 ト リプ卜ファン、 リジン、 アルギニン、 プロリンおよびァ スパラギン酸ないしその誘導体からなる群から選ばれたァ ミノ酸を単独あるいは複数組合せである場合、 あるいはま た有機合成されたリガンドが、 アルギニン、 ァスパラギン 酸、 フヱ^ルァラニン、 プロリンとスルファチアゾールを 組合せたものである場合、 例えばリンパ球分画の分離に用 いられた際より高純度、 高収率で安全性高く Tリンパ球お よび Bリンパ球を分離することができるものであり、 また 洗浄液と して等張緩衝液を用いるものであると、 Τ , Bリ ンパ球の分離はより容易にかつ好適に行なえるものとなり、 さらにまた分離材をゥシ血清アルブミンで処理した後、 こ リンパ球含有液を接触させるものであると、 分離効率にお いて純度を低下させることなく収率を向上させることがで き、 より優れた効果が细待できるものである。
    [0314] 本発明はさらに、 粒子状の水不溶性固体物質表面に免疫 グロプリンと高い親和性を有する有機合成されたリガンド を固定化してなる分離材を充填したカラムを有するこ.とを 特徴とする Bリンパ球の分離器であるから、 上記のごと く 優れた特性を有する Bリンパ球分離材と.リンパ球懸濁液等 の Bリンパ球含有液との接触をより効率よく行なうこと力 ^ でき、 Tリンバ球と B リンパ球の分離を短時間でかつ首尾 よく実施することが可能となり、 さらにカラムがボリプ口 ピレンまたはポリカ一ボネ一卜からなるものであり、 また 力ラムの出入口と分離材層との間には、 Bリンパ球含有液 中の細胞成分は通過するが分離材は通過できない網目を有 するフィルターを備えてなり 、 さらに該フィルターがボリ エステルまたはボリァミ ドからなるものであると 、 滅菌処 理等の操作も簡単でかつ通過する Bリンパ球含有液中の細 8ら
    [0315] 胞成分を損傷する虞れも少なく、 リンパ球分画の分離に用 いられた際にはより高純度、 高収率で Tリンパ球と Bリン パ球の分離を可能とするものである。
    [0316] またさらに本発明は水不溶性固体物質表面にスぺ一サ一 を介して、 免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成 されたリガンドが固定化されていることを特徴とする Bリ ンパ球分離材であるから、 Bリンパ球のみを選択的に捕捉 分離でき、 例えば末梢血あるいは生体組織から得られるリ ンパ球分画から、 Tリンパ球と Bリンパ球を簡便かつ迅速 に極めて高収率で高純度で分離することが可能であり、 し かも分離された Tリンパ球および Bリンパ球の機能的損傷 も少ないことから、 免疫機能に関係した疾患の診断、 治療 やリンパ球由来の生理话性物質を得るための基礎技術に応 用できるものである。 さらに本発明の Bリンパ球分離材に おいてスぺ一サ一が少なくとも 2個以上の炭素原子を有す る炭素水素鎖な ゝしは特性基を含む炭化水素鎮を骨格と るもの、 より好ましくはスぺ一サ一のメチレンの線返しが 4個以上の直鎮アルキルを骨格とするものまたは重合度 1 〜5 0のエチレンォキサイ ド骨格を有するものであると、 Tリンパ球の非特異的吸着がさらに仰制されて、 分離精度 はより高いものとなり、 さらに本発明の Bリンパ球分離材 において、 有機合成されたリガンドが、 複素環式化合物類 ベプチド類およびァミノ酸類からなる群から選ばれた 0 ) である場合、 より望ましくは複素環式化合物類が、 化学療 法材および誘導体、 ピリ ミジン関連化合物、 ピリジン関連 化合物ならびにピラジン閱連化合物からなる群から選ばれ たもの、 さらに望ましくは複素環式化合物類が、 サルファ 剤、 サルファ剤と p K 4 . 0〜9 . 0の色素との化合物、 2 - チォゥラシル、 イ ソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミ ノールからなる群から選ばれたものであり、 また望ま しく はオリゴぺプチド、 さらに望ましくはオリゴぺプチドが、 リジン、 チロシンによるオリゴペプチドあるいはァスパル チルフエ二ルァラニンアルキルエステルであり、 また望ま しくはアミノ酸類がパリン、 ロイシン、 チロシン、 フエ二 ルァラニン、 イ ソロイ シン、 トリブトフアン、 リジン. '、 ァ ルギニン、 プロリンおよびァスパラギン酸ないしその誘導 体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独あるいは複数組 合わせたものである場合、 あるいはまた有機合成されたリ ガンドが、 アルギニン'、 ァスパラギン酸、 フヱニルァラ二 ン、 プロリ ンとスルファチアゾ一ルを組合せてなるもので ある場合、 よ り高純度、 高収率で安全性高く Τリンパ球お よび Βリンパ球を得ることができるものとなり 、 さらに、 水不溶性固体物'質が平均粒径◦ . 0 5〜 5雇の粒子体であ るとよ り安定して効率よく Βリンパ球を分離することが可 能となる。 .
    [0317] また、 本発明は、 水不溶性固体物質表面にスべ一サーを 介して、 免疫グ口ブリンと高い親和性を有する有機合成さ れたリガンドを固定化してなる分離材に、 リンパ球含有液 を接触 せ、 膜表面に免疫グロプリン分子 （ S — I g ) を 有する Bリンパ球を選択的に捕捉せしめることを特徴とす る Bリンパ球の分離方法であるから、 処理操作において異 種生物由来の濃厚血清や生理活性物質を用いることがいつ さ なく簡便に精度の高い Bリンパ球分離を行なうことが できる。 加えて、 本発明の Bリンパ球の分離方法において 分離材におけるスぺーサ一が少なくとも 2個以上の炭素原 子を有する炭化水素鎖ないし特性基を含む炭化水素鎖を骨 格とするもの、 より好ましくはスぺ一サ一のメチレンの籙 返しが 4個以上の直 アルキルを骨格とするものまたは重 合度 1〜5 0のエレレンォキサイ ド骨格を有するものであ ると、 より高精度な Bリンパ球分離が期待でき、 さらに分 離材に固定化されたリガンドが、 複素環式化合物類.、 ぺプ チド類およびァミノ酸類からなる群から選ばれたものであ る場合、 より望ましくは複素環式化合物類が、 化学療法剤 およびその誘導体、 ピリ ミジン関連化合物からなる群から 選ばれたもの、 さらに望ましくは複素環式化合物類が、 サ ルファ剤、 サルファ剤と P K 4 · 0〜9 . 0の色素との化 合物、 2 -チォゥラシル、 ィ ソニコチン酸ヒ ドラジドおよ びルミノールからなる群から選ばれたものであり、 また望 ましくはべプチド類が、 ァミノ酸数 2〜 1 ◦程度のォリゴ ペプチド、 さらに望ましくはオリゴぺプチ卜が、 リジン、 チロシンによるオリゴべプチドあるいはァスバルチルフェ 二ルァラニンアルキルエステル、 また望ましくはアミノ酸 類が、 ノくリン、 ロイシン 、 チロシ ン' 、 フエ二ル ァラニン'、 イ ソロイ シン、 ト リプ卜フ ァン、 リジン、 アルギニン、 プ πリンおよびァスパラギン酸ないしその誘導体からなる群 から選ばれたアミノ酸を単独あるいは複数組合せたもので ある場合、 あるいはまた有機合成されたリガンドが、 アル ギニン、 ァスパラギン酸、 フヱニルァラニン、 プロ リ ンと スルファチアゾ一ルを組合せたものである場合、 例えば、 リンパ球分画の分離に用いられた際より高純度、 高収率で 安全性高ぐ Tリンパ球および Bリンパ球を分離することが できるものであり、 また洗浄液と して等張緩衝液を用いる ものであると τ , B y ンパ球の分離は容易にかつ好適に行 なえるものとなり、 より優れた効果が期待できるものであ る。 本発明はさちに、 粒子状の水不溶性固体物質表面に スぺーサーを介して免疫ダリプリンと高い親和性を有する 有機合成されたリガンドを固定化してなる分離材を充填し たカラムを有することを特徴とする Bリンパ球の分離器で あるから、 上記のごとく優れた特性を有する Bリンパ球分 離材と リンパ球懸濁液等の B リンパ球含有液との接触をよ り効率よく行なうことができ、 Bリンパ球の分離を短時間 でかつ首尾よく実施することが可能となり、 さらにカラム がボリプロピレンまたはボリカ一ボネートからなるもので あり、 またカラムの出入口と分離材層との間には、 B リ ン パ球含有液中の細胞成分は通過するが分離材は通過できな い網目を有するフ ィルタ一を備えてなり 、 さらに該フ ィル ターがポリエステルまたはポリアミ ドからなるものである と、 減菌処理等の操作も簡単でかつ通過する B リ ンパ球含 有液中の細胞成分を損傷する虞れも少なく、 リンパ球分画 の分離に用いられた際にはより高純度、 高収率で Tリンパ 球と Bリンパ球の分離を可能とするものである。
    [0318] さらにまた本発明は上述したように、 水不溶性担体表面 にジぺプチドあるいはその誘導体を固定化したことを特徴 とする体液浄化材であるから、 病因物質である免疫グロブ リン、 免疫複合体、 免疫関連可溶性因子等のタンパク質を 効率よぐかつ高い選択性をもって安全性高く吸着除去する ことが可能であり、 このため血液等の体液中から病因物質 を吸着除去し体液を浄化する浄化材として極めて適したも のとなり自己血漿浄化療法による自己免疫疾患、 免疫関連 疾患等の効果的治療を可能とするものであり、 またこのよ うな治療目的のみならず、 免疫グロブリ ン、 免疫複合体、 免疫鬨連可溶性因子等の体液特定成分の分離精製、 あるい はこれら成分の検査などの用途にも広くその応用が期待さ れるものであり、 さらにその活性は安定しているために製 造、 滅菌、 貯 、 運搬、 保管等も容易でありかつ価格的に も安価である。 さらに本発明の体液浄化材において、 ジぺ プチドぁ.るいはその誘導体が酸性ァミノ酸と芳香環ァミノ 酸または複素璟ァミノ酸とのジべプチドあるいはその誘導 体、 望ましくはァスバラギン酸もしくはグルタミン酸とフ ェニルァラニン 、 チロシン 、 卜 リプ卜ファン 、 プロリ ン しくはヒ ドロキシプロリンとのジべプチドあるいはその誘 導体、 さらに望ましくはァスパルチルフヱ二ルァラニンあ るいはその誘導体最も望ましくはァスパルチルフヱニルァ ラニンメチルエステルであり、 水不溶性担体が粒子状担体 特に平均粒径◦ . 0 5〜 S iiimの粒子状担体で、 さらに多孔 性を'有し、 また合成有機高分子、 天然有機高分子または無 機物からなるものである、 特に好ましくは多孔性ァクリル 酸エステル系粒子または多孔性キトサン粒子であり、 加え て、 ジぺプチドあるいはその誘導体が水不溶性担体表面に 共有結合により固定化されているも しくはスぺーサ一を介 して水不溶性担体表面.に共有結合により固定化されている ものであると上記したような特性はさらに優れたものとな りより優れた効果が期待できるものとなる。
    [0319] 本発明はさらに、 水不溶性担体表面にジぺプチドあるい はその誘導体を固定化してなる浄化材を充填したカラムを 有することを特徴とする体液浄化装置であるから、 上記の ごと く優れた特性を有する体液浄化材と体液の接触をより 容易に効率よく行なうことのできるものであり、 このため 自已血漿浄化療法における患者の体液からの病因物質の吸 着除去'、 あるいはこれら病因物質の分離精製、 ないしは検 查をよ り短時間でかつ首尾良く実施することが可能となる。 さらに本発明の体液浄化装置は湿熱滅菌処理を行なっても 性能を低下させることなく安定した吸着活性を示すゆえに、 よ り安全な治療ないし操作を行なうことができ、 さらに、 カラムがボリプロピレンまたはポリカーボネートからなる •Ϊのでありまたカラムの出入口と浄化材層との間には、 体 液成分は通過するが浄化材は通過できない網目を有するフ ィルターを備えてなるものであると、 滅菌処理等の操作も 簡単でかつ通過する体液中の成分を損傷する恐れも少なく . より安全にかつ効率よく病因物質を選択的に吸着除去でき るものとなる。 さらに本発明の体液浄化装置において、 体 液浄化材が粒子状の水不溶性担体表面にジぺプチドあるい はその^導体を固定化してなるものであり、 ジぺプチドぁ るいはその誘導体が酸性アミノ酸と芳香環アミノ酸または 複素環アミノ酸とのジぺプチドあるいはその誘導体、 さら に望ましくはァスパラギン酸もしくはグルタミン酸とフェ 二/レアラニン、 チロシン、 卜リプトフア ン 、 プロリンもし くはヒ ドロキシプロリンとのジべプチドあるいはその誘導 体、 より望ましくはァスバルチルフェニルァラニンあるい はその誘導体、 最も望ましくはァスパルチルフヱ二ルァラ ニンメチルエステルであり、 また水不溶性担体が平均粒径 0 . ◦ 5 〜 5 mmの粒子状のものであり、 さらに多孔性を有 するものであって、 かつ合成有機高分子、 天然有機高分子 または無機物からなるものである、 特に好ましくは、 多孔 性ァクリル酸エステル系粒子または多孔性キトサン粒子で あり、 またジべプチドあるいはその誘導体が水不溶性担体 表面に共有結合によりあるいはスべ一サーを介して水不溶 性担体表面に共有結合により固定化されているものである と、 より一層優れた特性を発揮するものとなる。
    [0320] 加えて本発明は、 患者から導出された血液を、 血球成分 と血漿成分に分離し、 得られた血漿成分を水不溶性担体表 面にジぺプチドあるいはその誘導体を固定化してなる休液 浄化材に接触させ、 この,ように体液浄化材で処理した血漿 成分を再び血球成分と混合して患者に返還する自己血漿浄 化法であるから、 血漿中に含まれるアルブミン等の有用成 分を除去することなく、 病因物質を選択的にかつ効率的に 除去することができるために、 前記したように自己免疫疾 患、 免疫関連疾患等の効果的治療を可能となし、 医療分野 において大きな貢献をもたらすものである。
    [0321] さらに本発明の自己血漿浄化法において、 ジぺプチドぁ るいはその誘導休が酸性アミノ酸と芳香環アミノ酸または 複素環アミノ酸とのジペプチドあるいはその誘導体、 さら に望ましくはァスパラギン酸もしくはグルタミン酸と フエ 二ルァラニン 、 チロシ ン 、 ト リプ卜 ファン、 プロ リ ンもし くはヒ ドロキシプロリンとのジペアチドあるいはその誘導 体、 よ り望ましくはァスパルチルフヱ二ルァラニンあるい はその誘導体、 最も望ましくはァスバルチルフェ二ルァラ ニンメチルエステルであり 、 また水不溶性担体が平均粒径 〇 . ◦ 5 5■の粒子状のものであり、 さらに多孔性を有 するものであって、 かつ合成有機高分子、 天然有機高分子 または無機物からなるものである、 特に好ましくは、 多孔 性ァクリル酸エステル系粒子または多孔性キ 卜サン粒子で あり、 またジぺプチドあるいはその誘導体が水不溶性担体 表面に共有結合によりあるいはスベーサーを介して水不溶 性担体表面に共有結合により固定化されているものである と、 より一層顕著な治療効果が期待できるものである。
    权利要求:
    Claims言青求の範囲 '
    1 . 水不溶性固体物質表面に、 免疫グロブリンと高い親和 性を有する有機合成されたリガンドを固定化したことを特 徴とする Bリンパ球分離材。
    2 . 有機合成されたリガンドが、 複素環式化合物類、 ぺプ チド類およびアミノ酸類からなる群から選ばれたものであ る請求の範囲第 1項に記載の Bリンパ球分離材。
    3 . 複素環式化合物類が、 化学療法剤およびその誘導体、 ピリ ミジン関連化合物、 ピリジン関連化合物ならびにビラ ジン関連化合物からなる群から選ばれたものである請求の 範囲第 2項に記載の Bリンパ球分離材。
    4 . 複素環式化合物類が、 サルファ剤、 サルファ剤と P K 4 . 0〜 9 . ◦の色素との化合物、 2 - チォゥラシル、 ィ
    ― ソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミノ一ルからなる群から 選ばれたものである請求の範囲第 3項に記載の Βリンパ球 分離材。
    5 . ペプチド類が、 アミノ酸数 2〜 1 0程度のオリゴぺプ チドである請求の範囲第 2項に記載の Βリンパ球分離材。
    6 . 才リ ゴぺプチドが、 リジン、 チロシンによるォリゴぺ プチドあるいはァスパルチルフエ二ルァラニンアルキルェ ステルである請求の範囲第 5項に記載の Βリン )、。球分離材。
    7 . アミノ酸類が、 ノ リ ン'、 ロイ シン'、 チロシン'、 フエ二 ルァラニン'、 ィ ゾロイ シ ン， ト リ フ。ト フ ァン、 リ ジン、 ァ ルギニン、 プロリ ンぉよびァスパラギン酸ないしその誘導 体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独あるいは複数組 合せたものである請求の範囲第 2項に記載の Bリンパ球分 離材。
    8 . 有機合成されたリガンドが、 アルギニン、 ァスパラギ ン酸、 フエ二ルァラ二-ン、 プロリンとスルファチアゾ一ル を組合せてなるものである請求の範囲第 1項または第 2項 に記載の Bリンパ球分離材。
    9 . 水不溶性固体物質が、 合成有機高分子、 天然有機高分 子または無機物からなる粒子体である請求の範囲第 1項〜 第 8項のいずれかに記載の Bリンパ球分離材。
    1 0 . 水不溶性固体物質が、 平均粒径 0 . 0 5 〜 5 删の粒 子体である請求の範囲第 1項〜第 9項のいずれかに記載の Bリンパ球分離材。
    1 1 . 有機合成されたリガンドが、 水不溶性固体表面に共 有結合により固定化されているものである請求の範囲第 1 項〜第 1 ◦項のいずれかに記載の Bリンパ球分離材。
    1 2 . 水不溶性固体物質表面に免疫グロブリンと高い親和 性を有する有機合成されたリガンドを固定化してなる分離 材に、 Bリンパ球含有液を接触させ、 膜表面に免疫グロブ リン分子 （ s— I g )を有する Bリンパ球を選択的に捕捉せ しめることを特徴とする Bリンパ球の分離方法。
    1 3 . 分離材に固定化されたリガンドが、 複素環式化合物 類、 ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選ばれた ものである請求の範囲第 1 2項に記載の Bリンパ球の分離 方法。
    1 4 . 複素環式化合物類が、 化学療法剤およびその誘導体 ピリ ミジン閧連化合物、 ピリジン鬨連化合物ならびにビラ ジン閲連化合物からなる群から選ばれたものである請求の 範囲第 1 3項に記載の Bリンパ球の分離方法。
    1 5 . 複素環式化合物類が、 サルファ剤、 サルファ剤と P K 4 . 0〜9 . 0の色素との化合物、 2 - チォゥラシル、 イ ソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミノールからなる群か ら選ばれたものである請求の範囲第 1 4項に記載の Bリン パ球の分離方法。 '
    1 6 . ぺプチド類が、 ァミノ酸数 2〜 1 0程度のォリゴぺ プチドである請求の範囲第 1 3項に記載の Bリンパ球の分 離方法。 -
    1 7 . オリゴペプチドが、 リジン、 チロシンによる才リゴ ぺプチドあるいはァスバルチルファ二ルァラニンアルキル エステルである請求の範囲第 1 6項に記載の Bリンパ球の 秀 分離方法。
    1 8 . アミノ酸類が、 ノくリン、 ロイ シン、 チロシン、 フエ 二ルァラニン、 イ ソロイシン、 ト リプトファン、 リジン、 アルギニン、 プロリンおよびァスパラギン酸ないしその 導体からなる群から選ばれたアミ ノ酸を単独あるいは複数 組合せたものである請求の範囲第 1 3項に記載の B リンバ 球の分離方法。
    1 9 . 分齄材に固定されたされたリガンド力 アルギニン ァスパラギン酸、 フエ二ルァラニン、 プロリンと'スルファ チアゾ一ルを組合せてなるものである請求の範囲第 1 2項 に記載の Bリンパ球の分離方法。
    2 0 . 水不溶性固体物質が、 合成有機高分子、 天然有機高 分子または無機物からなるものである請求の範囲第 1 2項 〜第 1 9項のいずれかに記載の Bリンパ球の分離方法。
    2 1 . 洗浄液として等張緩衝液を用いるものである請求の 範囲第 1 2項に記載の Bリンパ球の分離方法。
    2 2 . 分離材をゥシ血清アルブミンで処理した後、 リンパ 球懸濁液と接触させるものである請求の範囲第 1 2項に記 載の Bリンパ球の分離方法。
    2 3 . 粒子状の水不溶性固体物質表面に免疫グロプリンと 高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化して なる分離材を充填したカラムを有することを特徴とする B リ ンパ球の分離器。
    2 4 . カラムがポリプロピレンまたはボリ力一ボネートか らなる のである請求の範囲第 2 3項に記載の Bリンパ球 の分離器。
    2 5 . カラムの出入口と分離材層との間には、 Bリンパ球 含有液中の細胞成分は通過するが分離材は通過できない網 目を有するフ ィルターを備えてなるものである特許請求の 範囲第 2 3項または第 2 4項に記載の Bリンパ球の分離器 2 6 . フ ィルターがボリエステルまたはポリアミ ドからな るものである請求の範囲第 2 5項に記載の B リ ンパ球の分
    2 7 . 水不溶性固体物質表面にスぺーサ一を介して、 免疫 グロプリンと高い親和性を有する有機合成されたリガンド が固定化されていることを特徴とする Bリンパ球分離材。 2 8 . スぺーサ一が少なく とも 2個以上の炭素原子を有す る炭化水素鎖ないしは特性基を含む炭化水素鎖を骨格とす るものである請求の範囲第 2 7項に記載の Bリンパ球分離 材。
    2 9 . スぺーサ一のメチレンの繰返しが 4個以上の直鎮ァ ルキルを骨格とするものである請求の範囲第 2 8項に記載 の- B リンパ球分離材。
    3 〇 . スぺーサ一が重合度 1〜 5 0のエチレンォキサイ ド 骨格を有するものである請求の範囲第 2 8項に記載の Bリ ンパ球分離材。
    3 1 . 有機合成されたリガンドが、 複素環式化合物類、 ぺ プチド類およびアミノ酸類からなる群から選ばれた ので ある請求の範囲第 2 7項〜第 3 0項のいずれかに記載の B リンパ球分離材。 .
    3 2 . 複素環式化合物類が、 化学療法剤およびその誘導体 ピリ ミジン閲連化合物、 ピリジン関連化合物ならびにビラ ジン関連化合物からなる群から選ばれたものである請求の 範囲第 3 1項に記載の B リ ンパ球分離材<
    3 3 . 複素環式化合物類が、 サルファ剤、 サルファ剤と P K 4 . 0〜9 . 0の色素との化合物、 2 · チォゥラシル、 イソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミノールからなる群か ら選ばれたものである請求の範囲第 3 2項に記載の Bリン パ球分離材。
    3 4 . ぺプチド類が、 アミノ酸数 2 〜 1 0程度のオリゴぺ プチドである請求の範囲第 3 1項に記載の B リンパ球分離 材。
    3 5 . オリゴペプチドが、 リジン、 チロシンによるオリゴ ぺプチドあるいはァスパルチルファニルァラニンアルキル エステルである請求の範囲第 3 4項に記載の Bリンパ球分 離材ぐ 、
    3 6 . アミノ酸類が、 バリ ン、 ロイシン、 チロシン、 フエ 二ルァラニン、 イソロイシン、 トリプ卜ファン、 リジン、 アルギニン、 プロリンおよびァスパラギン酸ないしその誘 導休からなる群から選ばれたァミノ酸を単独あるいは複数 組合せたものである請求の範囲第 3 1項に記載の Bリンパ 球分離材。
    3 7 . 有機合成されたリガンドが、 アルギニン、 ァスパラ ギン酸、 フエ二ルァラニン、 プロリンとスルファチアゾー ルを組合せてなるものである請求の範囲第 3 1項に記载の Bリンパ球分離材。
    3 8 . 水不溶性固体物質が、 合成有機高分子、 天然有機高 分子または無機物からなる粒子体である請求の範囲第 2 7 項〜第 3 7項のいずれかに記載の Bリンパ球分離材。
    3 9 . 水不溶性固体物質が、 平均粒径 0 . ◦ 5 〜 5 蘭の粒 子体である請求の範囲第 2 7項〜第: 3 8項のいずれかに記 載の Bリンパ球分離材。
    4 0 . 水不溶性固体物質表面にスぺーサーを介して免疫グ ロブリンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドを 固定化してなる分離材に、 Bリンパ球含有液を接触させ、 膜表面に免疫グロプリン分子 （ S— I g ) を有する B リ ン パ球を選択的に捕捉せしめることを特徴とする Bリンパ球 の分離方法。
    4 1 . 分離材におけるスぺーサ一が少なく とも 2個以上の 炭素原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を含む炭化水 素鎖を骨格とするものである請求の範囲第 4 0項に記載の B リ ンパ球の分離方法。 .
    4 2 . 分離材におけるスぺ一サーのメチレンの繰返しが 4 個以上の直鎖アルキルを骨格とするものである請求の範囲 第 4 1項に記載の Bリンパ球の分離方法。
    4 3 . 分離材におけるスぺ一サ一が重合度 1〜5 0のェチ レンォキサイ ド骨格を有す,る のである請求の範囲第 4 1 項に記載の Bリンパ球の分離方法。
    4 4 . 分離材に固定化されたリガンドが、 複素環式化合物 類、 ぺプチド類およびァミノ酸類からなる群から選ばれた ものである請求の範囲第 4 0項〜第 4 3項のいずれかに記 載の Bリンパ球の分離方法。
    4 5 . 複素環式化合物類が、 化学療法剤およびその誘導体、 ピリ ミジン閲連化合物、 ピリジン関連化合物ならびにビラ ジン関連化合物からなる群から選ばれたものである請求の 範囲第 4 4項に記載の Bリンパ球の分離方法。
    4 6 複素環式化合物類が、 サルファ剤、 サルファ剤と P K 4 . 0〜9 . 0の色素との化合物、 2 -チォゥラシル、 イソニコチン酸ヒ ドラジドおよびルミノールからなる群か ら選ばれたものである請求の範囲第 4 5.項に記載の Bリン パ球の分離方法。
    4 7 . ぺプチド類が、 アミノ酸数 2〜 1 ◦程度のオリゴぺ プチドである請求の範囲第 4 4項に記載の Bリンパ球の分 離方法。
    -4 8 . オリゴペプチドが、 リジン、 チロシンによるオリゴ ぺプチドあるいはァスパルチルフエ二ルァラニンアルキル エステルである請求の範囲第 4 7項に記載の Bリンパ球の 分離方法。
    4 9 . ァミノ酸類が、 バリ ン、 ロイ シン、 チロシン、 フエ 二ルァラニン、 イ ソロイ シン、 ト リプ卜フ ァン、 リ ジン、 アルギニン、 プロリンおよびァスパラギン酸ないしその誘 導休からなる群から選ばれたアミノ酸を単独あるいは複数 組合せたものである請求の範囲第 4 4項に記載の Bリンパ 球の分離方法。 -
    5 0 . 分離材に固定されたされたリガンドが、 アルギニン ァ又パラギン酸、 フエ二ルァラニン、 プロリ ンとスルファ チアゾ一ルを組合せてなるものである請求の範囲第 4 4項 に記載の B リ ンパ球の分離方法。 1 〇 3
    5 ] . 水不溶性固体物質が、 合成有機高分子、 天然有機高 分子または無機物からなるものである請求の範囲第 4 0項 〜第 5 0項のいずれかに記載の Bリンパ球の分離方法。 5 2 . 洗浄液と して等張緩衝液を用いるものである請求の 範囲第 4 ◦項に記載の Bリンパ球の分離方法。
    5 3 . 粒子状の水不溶性固体物質表面にスぺーサーを介し て免疫グロプリンと高い親和性を有する有機合成されたリ ガンドを固定化してなる分離材を充填したカラムを有する ことを特徴とする Bリンパ球の分離器。
    5 4 . カラムがポリプロピレンまたはポリカーボネートか らなるものである請求の範囲第 5 3項に記載の Bリンパ球 の分離器。
    5 5 . カラムの出入口と分離材層との間には、 Bリンパ球 含有液中の細胞成分は通過するが分離材は通過できない網 目を有するフ ィルタ一を備えてなるものである請求の範囲 第 5 3項または第 5 4項に記載の Bリンパ球の分離器。 5 6 . フィルターがポリエステルまたはポリアミ ドからな るものである請求の範囲第 5 5項に記載の Bリンパ球の分
    5 7 . 水不溶性担体表面にジぺプチドあるいはその誘導体 を固定化したことを特徴とする体液浄化材。
    5 S . ジぺプチドあるいはその誘導体が酸性アミノ酸と芳 香環アミノ酸または複素環アミノ酸とのジペプチドあるい はその誘導体である請求の範囲第 5 7項に記載の体液浄化 材。
    5 9 . ジぺプチドあるいはその誘導体がァスパラギン酸も しくはグルタミン酸とフエ二ルァラニン、 チロシン、 トリ プ卜ファン、 プロリンもしくはヒ ドロキシプロリンとのジ ぺプチドあるいはその誘導体である請求の範囲第 5 7項ま たは第 5 8項に記載の体液浄化材。
    6 0 . ジペプチドあるいはその誘導体がァスパルチルフエ 二ルァラニンあるいはその誘導体である請求の範囲第 5 7 項〜第 5 9項のいずれかに記載の体液浄化材。
    6 1 . ジペプチドあるいはその誘導体がァスパルチルフエ 二ルァラニンメチルエステルである請求の範囲第 6 ◦項に 記載の体液浄化材。
    6 2 . 水不溶性担体が粒子状担体である請求の範囲第 5 7 項〜第 6 1項のいずれかに記載の体液 化材。
    6 3 . 粒子状担体が平均粒径 0 . 0 5〜 5關のものである 請求の範囲第 6 2項に記載の体液浄化材。
    6 4 . 水不溶性担体が多孔性のものである請求の範囲第 5
    7項〜第 6 3項のいずれかに記載の体液浄化材
    6 5 . 水不溶性担体が合成有機高分子、 天然有機高分子ま たは無機物からなるものである請求の範囲第 5 7項〜第 6
    4項のいずれかに記載の体液浄化材。
    6 6 . 水不溶性担体が多孔性ァク リル酸エステル系粒子ま たは多孔性キトサン粒子である請求の範囲第 5 7項〜第 6
    5項のいずれかに記載の体液浄化材。
    6 7 . ジべプチドあるいはその誘導体が水不溶性担休表面 に共有結合によ り固定化されているものである請求の範囲 第 5 7項〜第 6 6項のいずれかに記載の体液浄化材。
    6 8 . ジぺプチドあるいはその誘導体がスべ一サーを介し て水不溶性担体表面に共有結合により固定化されているも のである請求の範囲第 5 7項〜第 6 6項のいずれかに記載 の体液浄化材。
    6 9 . 水不溶性担体表面にジぺプチドあるいはその誘導体 を固定化してなる浄化材を充填したカラムを有することを 特徴とする体液浄化装置。
    7 0 . 湿熟滅菌処理されたものである請求の範囲第 6 9項 に記載の体液浄化装置。
    7 1 . 浄化材が粒子状の水不溶性担体表面にジペプチドあ るいはその誘導体を固定化してなるものである請求の範囲 第 6 9項または第 7 0項に記載の体液浄化装置。
    7 2 . カラムがホ。リプ口ピレンまたはポリ 'カーボネートか らなるものである請求の範囲第 6 9項〜第 7 1項のいずれ かに記載の体液浄化装置。
    7 3 . カラムの出入口と浄化材層との間には、 体液成分は 通過するが浄化材は通過できない網目を有するフ ィルター を備えてなるものである請求の範囲第 6 9項〜第 7 2項の いずれかに記載の体液浄化装置。
    7 4 . ジべプチドあるいはその誘導体が酸性アミノ酸と芳 香環アミノ酸または複素環アミノ酸とのジぺプチドあるい はその誘導体である請求の範囲第 6 9項〜第 7 3項のいず れかに記載の体液浄化装置。
    7 5 . ジペプチドあるいはその誘導体がァスパラギン酸も しぐはグルタミン酸とフエ二ルァラニン、 チロシン、 トリ プ卜ファン、 プロリンもしくはヒ ドロキシプロリンとのジ ぺプチドあるいはその誘導体である請求の範囲第ら 9項〜 第 7 4項のいずれかに記載の体液浄化装置。
    7 6 . ジペプチドあるいはその誘導体がァスパルチルフエ 二ルァラニンあるいはその誘導体である請求の範囲第 6 9 項〜第 7 5項のいずれかに記載の体液浄化装置。
    7 7 . ジペプチドあるいはその誘導体がァスパル'チルフヱ 二ルァラニンメチルエステルである請求の範囲第 7 6項に 記載の体液淨化装置。
    7 8 . 粒子状の水不溶性担休が平均粒径◦ . 0 5〜 5 の ものである請求の範囲第 6 9項〜第 7 7項のいずれかに記 載の体液浄化装置。 .
    7 9 . 水不溶性担体が多孔性のものである特許請求の範囲 第 6 9項〜第 7 8項のいずれかに記載の体液浄化装置。
    8 0 . 水不溶性担体が合成有機高分子、 天然有機高分亍ま たは無機物からなるものである請求の範囲第 6 9項〜第 7
    - 9項のいずれかに記載の体液浄化装置。
    S 1 . 水不溶性担体が多孔性ァクリル酸エステル系粒子ま たは多孔性キトサン粒子である請求の範囲第 6 9項〜第 8 0項のいずれかに記載の体液浄化装置。
    8 2 . ジペ^チドあるいはその誘導体が水不溶性担体表面 に共有結合により固定化されているものである請求の範囲 第ら 9項〜第 S 1項のいずれかに記載の体液浄化装置。 8 3 . ジぺプチドあるいはその誘導休がスぺーサーを介し て水不 性担体表面に共有結合により固定化されているも のである請求の範囲第 6 9項〜第 8 2項のいずれかに記載 の体液浄化装置。
    8 4 . 患者よ り導出された血液を、 血球成分と血漿成分と に分離し、 得られた血漿成分を請求の範囲第 5 7項に記載 の体液浄化材と接触させ、' このようにして体液浄化材で処 理した血漿成分を再び血球成分と混合して患者に返還する 自己血漿浄化方法。
    8 5 . 患者より導出された血液を、 血球成分と血漿成分 に分離し、 得られた血漿成分を請求の範囲第 6 8項に記載 の体液浄化材と接触させ、 このようにして体液浄化材で処 理した血漿成分を再び血球成分と混合して患者に返還する 自己血漿浄化方法。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    AU2016250389B2|2018-03-15|Separation material comprising saccharide ligands
    JP6580650B2|2019-09-25|フロースルー式での生物製剤からのタンパク質凝集体の除去
    AU2012204271B2|2015-08-13|Polymeric sorbent for removal of impurities from whole blood and blood products
    JP5643721B2|2014-12-17|アフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよびその作成および使用法
    US5547576A|1996-08-20|Pathogenic substance removing material and a blood filter containing the material
    KR101149969B1|2012-07-05|항체 정제
    US4576928A|1986-03-18|Adsorbent and process for preparing the same
    JP5345539B2|2013-11-20|抗体単離のためのスタフィロコッカスアウレウス由来のドメインｃを含むクロマトグラフィーリガンド
    EP1968634B1|2014-07-16|PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE CONCENTRE D&#39; IMMUNOGLOBULINES G | APPAUVRI EN ANTICORPS ANTI-A ET ANTI-B
    DE69531826T2|2004-07-08|Chromatographische adsorbenden, die merkaptoheterozyklische liganden anwenden
    Chuang et al.1978|Interaction of plasma proteins with artificial surfaces: protein adsorption isotherms
    US8603345B2|2013-12-10|Devices for component removal during blood collection, and uses thereof
    ES2221957T3|2005-01-16|Metodo para la eliminacion cromatografica de priones.
    DE69926081T2|2006-04-20|Entfernung von prionen aus blut, plasma und anderen flüssigkeiten
    DE69332926T2|2004-03-11|Kontinuierliches zentrifugationsverfahren zum abtrennen von biologischen komponenten aus heterogenen zellpopulationen
    US9522365B2|2016-12-20|Cross-linked cellulose membranes
    Chase1984|Affinity separations utilising immobilised monoclonal antibodies—a new tool for the biochemical engineer
    JP6195443B2|2017-09-13|タンパク質及びペプチドと結合する特定の充填剤、並びに、それを用いた分離方法
    US5123901A|1992-06-23|Method for separating pathogenic or toxic agents from a body fluid and return to body
    EP0180766A2|1986-05-14|Intravenously injectable immunoglobulin G | and method for producing the same
    EP0173500A1|1986-03-05|Methods of concentrating ligands and active membranes used therefor
    RU2386967C2|2010-04-20|Устройство и способ для выделения клеток, биочастиц и/или молекул из жидкостей с целью применения у животных, в биотехнологии | и медицинской диагностике
    TWI392685B|2013-04-11|利用親和力色析之連續蛋白質分離及純化流程
    EP1326708B1|2006-07-05|Adsorbens mit unterschiedlich modifizierten oberflächenbereichen, verfahren zu dessen herstellung und verwendung davon
    EP0804734B1|2005-05-04|Sterile and pyrogen-free columns coupled to protein for binding and removal of substances from blood
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    AU1576088A|1988-11-04|
    AU620329B2|1992-02-20|
    EP0358758A1|1990-03-21|
    EP0358758A4|1990-02-26|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    JPS5936961B2|1979-04-10|1984-09-06|Asahi Chemical Ind||
    JPS603367B2|1979-10-09|1985-01-28|Asahi Chemical Ind||
    JPS58170717A|1982-03-31|1983-10-07|Teiji Tsuruta|B-cell separating material, separator and process therefor|
    JPS639450A|1986-06-28|1988-01-16|Terumo Corp|Body fluid component separating material and body fluid component separator equipped therewith|US5654334A|1995-06-23|1997-08-05|Oklahoma Medical Research Foundation|Analgesic use of N-L-α-aspartyl-L-phenylalanine 1-methyl ester|US4432871A|1981-01-22|1984-02-21|Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha|Immune adsorbent, adsorbing device and blood purifying apparatus|
    US4430229A|1981-05-22|1984-02-07|Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha|Immune adsorbent and adsorbing device|
    FR2582815B1|1985-05-31|1989-04-07|Commissariat Energie Atomique|Procede de separation des anticorps antifacteur viii : c, utilisable notamment pour l'epuration du plasma sanguin d'un hemophile de type a|JPH0731196B2|1989-03-28|1995-04-10|技術研究組合医療福祉機器研究所|複雑抗原抗体反応系における細胞同定法及びこの方法に使用される細胞固相化装置|
    法律状态:
    1988-10-20| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU US |
    1988-10-20| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): BE CH DE FR GB SE |
    1989-10-09| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988903364 Country of ref document: EP |
    1990-03-21| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988903364 Country of ref document: EP |
    1993-02-16| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1988903364 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    [返回顶部]